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研究背景:目前,乳腺癌已经成为女性最常见诊断出的恶性肿瘤,并且成为世界女性癌症相关死亡中仅次于肺癌的第二大恶性肿瘤。根据最新版的世界癌症统计报告,我国乳腺癌发病率呈现逐年上升趋势,发病人数已从2015年的30万增加到2020年的42万,且乳腺癌发病人群的年龄日益年轻化。三阴性乳腺癌（Triplenegativebreastcancer,TNBC）的发生率约占所有新诊断乳腺癌的10-15%,是恶性程度最高,预后最差的一种特殊类型的乳腺癌,其主要特征是缺乏雌激素（Estrogen receptor,ER）、孕激素（Progesterone Receptor,PR）和人表皮生长因子受体 2（Human epidermal growth factor receptors-2,HER-2）的表达。TNBC患者由于缺乏合适的治疗策略,目前仍以化疗为主要的治疗方式。然而,TNBC患者经常会发生原发性或获得性化疗耐药从而导致化疗效果不良,严重影响TNBC患者的生存及预后。因此探索三阴性乳腺癌化疗耐药的分子机制,寻找三阴性乳腺癌化疗耐药的关键分子,开发相应的靶向药物,一直以来都是乳腺癌研究的重要方向。着丝粒蛋白F（Centromere Protein F,CENPF）是着丝粒蛋白家族成员之一,其表达与定位具有严格的细胞周期依赖性,参与细胞分裂、基因表达调控、细胞形态发生、囊泡运输和纤毛发生等多种生物学过程。最近研究发现,CENPF在多种恶性肿瘤中高表达,例如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和肺腺癌等,主要通过激活肿瘤恶性进展相关的信号通路,促进癌细胞的增殖、转移和化疗耐药。目前,CENPF在三阴性乳腺癌化疗耐药中的作用及机制鲜有报道。本研究中,我们系统分析了 CENPF在三阴性乳腺癌化疗耐药中的作用及分子调控机制,为探讨三阴性乳腺癌化疗耐药新机制和靶向治疗新靶点提供新的思路和理论基础。研究方法:使用生物信息学、免疫组织化学染色和实时定量PCR分析,探究CENPF在三阴性乳腺癌组织和细胞中的表达情况,分析CENPF表达与患者临床病理参数及生存预后的关系。体外检测CENPF对三阴性乳腺癌细胞增殖、凋亡、周期、药物敏感性的作用。利用GSEA富集分析、实时定量PCR、Western blot、免疫荧光共定位和免疫共沉淀实验检测CENPF互作蛋白及其在化疗耐药中的作用机制。结果:1.CENPF在三阴性乳腺癌中表达及预后情况GEO、TCGA以及HPA数据库分析结果显示:相比于正常乳腺组织,CENPF的表达在乳腺癌组织中明显升高,且在三阴性乳腺癌组织中升高更为显著。通过Kaplan Meier Plotte网站进行生存分析发现,CENPF高表达与乳腺癌总体生存率和无复发生存率呈负相关,且与具有新辅助治疗史的三阴性乳腺癌患者不良预后密切相关。从GEO数据库获取了 GSE25066数据集中的三阴性乳腺癌新辅助化疗后残存组织（RD）患者生存预后数据,生存分析结果显示:CENPF高表达的三阴性乳腺癌RD患者具有较低的生存率。此外,通过免疫组织化学染色检测32例三阴性乳腺癌新辅助化疗患者组织中的CENPF表达情况,结果显示:与化疗敏感组织相比,CENPF在三阴性乳腺癌化疗耐药组织中表达上调。临床病理参数分析提示:CENPF高表达与三阴性乳腺癌化疗耐药相关。我们借助CCLE数据库分析了 CENPF在多种乳腺癌细胞系中的表达情况,结果显示:与非三阴性乳腺癌细胞相比,CENPF在三阴性乳腺癌细胞中表达上调。实时定量PCR检测结果显示:与化疗敏感的MDA-MB-231细胞相比,CENPF在化疗耐药细胞MDA-MB-231/ADR中表达上调。2.靶向干预CENPF显著提高三阴性乳腺癌细胞对阿霉素的化疗敏感性实时定量PCR和Western blot检测结果显示:与对照组相比,si-CENPF转染可明显下调CENPF的表达。细胞转染后,我们进行药物敏感性、CCK-8增殖、细胞凋亡和细胞周期等细胞功能学实验,实验结果分析发现,靶向干预CENPF表达增强TNBC细胞对阿霉素的化疗敏感性,增强阿霉素诱导的细胞凋亡,抑制阿霉素诱导的G2/M期阻滞。而CENPF对三阴性乳腺癌细胞的增殖能力无明显影响。3.在三阴性乳腺癌细胞中,存在CENPF-Chk1轴调控阿霉素敏感性我们通过GEPIA数据库中的TCGA数据集分析,发现CENPF和Chk1表达的呈正相关。随后,实时定量PCR和Western blot检测结果显示:与对照组相比,靶向抑制CENPF可明显下调Chk1的mRNA和蛋白表达。Chk1磷酸化是阿霉素引起DNA损伤响应的关键因素,我们通过Western blot进一步检测发现:靶向抑制CENPF通过负向调控Chk1转录减少了 Chk1总蛋白水平,进而降低了阿霉素作用条件下的Chk1磷酸化水平。4.CENPF通过Rb-E2F轴转录调控Chk1表达通过对GEO数据库中的GSE86374数据集进行GSEA富集分析发现,CENPF高表达主要富集在细胞周期、E2F靶标、G2/M期检测点等通路。实时定量PCR和Western blot验证发现,敲低CENPF后可显著抑制Rb磷酸化水平。免疫荧光共定位实验和免疫共沉淀实验结果表明:CENPF与Rb蛋白相互作用,并通过影响Rb的磷酸化来调控E2F1的转录活性,抑制Chk1的表达。靶向抑制CENPF可通过Rb-E2F轴调控Chk1的表达以促进肿瘤细胞对阿霉素的化疗敏感性。结论及意义:CENPF在三阴性乳腺癌中表达显著升高,且CENPF高表达与三阴性乳腺癌化疗耐药和不良预后密切相关。靶向抑制CENPF可明显提高三阴性乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性,增强阿霉素诱导的细胞凋亡,抑制阿霉素诱导的G2/M期阻滞。CENPF结合并促进Rb蛋白磷酸化,通过Rb/E2F1轴促进Chk1表达,以增强三阴性乳腺癌对阿霉素的化学抗性。本研究首次对CENPF在三阴性乳腺癌化疗耐药中的作用及机制进行探讨,提出了 CENPF调控Chk1表达参与三阴性乳腺癌化疗耐药的新机制,有望为三阴性乳腺癌化疗耐药患者的治疗提供新靶点。