【摘 要】
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近年来,β-葡萄糖苷酶因在食品工业等方面的应用受到广泛关注。本文通过探索木薯块根中的β-葡萄糖苷酶的测定条件,并对其进行分离纯化、酶学性质及应用研究,为日后木薯β-葡萄糖苷酶的应用提供理论基础。通过对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG）法,分别探索反应温度、缓冲液类型、反应体系p H、反应时间和底物添加量对吸光值的影响,最终确定木薯块根β-葡萄糖苷酶的最佳测定条件为:p H为7.0的磷酸氢
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近年来,β-葡萄糖苷酶因在食品工业等方面的应用受到广泛关注。本文通过探索木薯块根中的β-葡萄糖苷酶的测定条件,并对其进行分离纯化、酶学性质及应用研究,为日后木薯β-葡萄糖苷酶的应用提供理论基础。通过对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG）法,分别探索反应温度、缓冲液类型、反应体系p H、反应时间和底物添加量对吸光值的影响,最终确定木薯块根β-葡萄糖苷酶的最佳测定条件为:p H为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液,加入10m M p-NPG 0.1m L,47℃水浴30 min后定容,混匀,在400 nm处测定吸光度。通过单因素试验探索提取液p H值、缓冲液类型、料液比、匀浆时间和离心转速对木薯块根β-葡萄糖苷酶提取的影响,并对影响较大的因素进行响应面试验优化。通过对总活力及比活力的考察,确定木薯块根β-葡萄糖苷酶的最佳提取条件为:p H为4.5,匀浆时间60.0 s,离心转速10000.0 r/min,提取的木薯块根β-葡萄糖苷酶总活力9.901 U/g干重,比活力15.955 U/mg。对木薯块根β-葡萄糖苷酶进行初步纯化,通过比较硫酸铵沉淀、乙醇沉淀、丙酮沉淀和等电点沉淀的纯化效果,确定丙酮沉淀作为初步纯化的效果最好,酶活力回收率为91.911%,纯化倍数为1.751倍。通过丙酮沉淀,离子层析和凝胶过滤层析对木薯块根β-葡萄糖苷酶纯化,得到的总活力1.138 U/g干重,比活力为228.159 U/mg,纯度提高了14.623倍,酶回收率为12.143%。酶纯化后电泳测得其分子量约为70 k Da。研究了木薯块根β-葡萄糖苷酶的温度、p H和保存稳定性,分析温度、p H、金属离子和部分有机物对酶的影响,测定了酶水解p-NPG的动力学常数,探索了木薯块根β-葡萄糖苷酶的酶学性质。木薯块根β-葡萄糖苷酶在45℃以内有较高的稳定性,可耐受65-70℃高温,变性温度在60℃左右。酶的等电点为p H4.5,在p H为5.0-7.0之间较稳定,p H为7.0时显示有最大活性。部分金属离子和有机物对β-葡萄糖苷酶有一定影响,其中Mn2+和K+对酶有一定的促进作用,而Fe3+、Fe2+、Cu2+、Ag+和EDTA会对酶造成不同程度的伤害。木薯块根中的β-葡萄糖苷酶有较好的水解p-NPG的能力,水解其他苷类等物质的能力待进一步研究。木薯块根β-葡萄糖苷酶在存放30天仍然有81.778%的酶活,可见有较好的储藏性。添加木薯块根β-葡萄糖苷酶测定蒸后木薯中氰化物含量,并通过HPLC-ELSD进行验证,测得木薯块根在蒸后20 min氰化物含量仍然有19.280μg/g,在蒸50 min以后达到10μg/g以下。
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