我国是乙型肝炎的高流行区，有50％-70％的人群受过乙型肝炎病毒(HBV)的感染。部分感染者转为慢性感染过程，造成肝功损害，并有证据表明HBV感染与肝癌的发生密切相关。HBV整合感染特性和免疫耐受机制又给乙肝的治疗带来困难，临床无特效药物，接种疫苗是控制HBV感染的根本手段。现有的乙肝血源疫苗及基因工程多肽疫苗在若干方面不尽如人意，如铝佐剂仅具有单向免疫调节作用，缺乏诱生TH1方向的细胞免疫作用而导致部分接种对象产生无效免疫应答(尤其是成人)，接种次数多，成本高，需要冷链运输设备，尤其是部分人群对免疫注射有一定的恐惧心里，甚至拒绝接种。 那么，怎样才能使疫苗刺激机体产生THI、TH2双向免疫反应、提高免疫效果、减少注射烦恼? 目前乙肝基因工程疫苗成分为HBsAg蛋白，另外混有铝佐剂以增强免疫效果。 S基因第156-832区编码含226个氨基酸，该片段含有中和性a抗原决定簇位(主蛋白aa124-aa147区段)，能够广泛被MHC分子所识别，该序列保守且稳定，是制作疫苗的理想片段，已由研究分析表明：整个HBsAg主蛋白的结构，两个主要的亲水区Ⅰ(aa24-aa79)和Ⅱ(aa99-aa168)镶嵌于三个疏水区(分别位于aa7-aa23、aa80-aa98和aa169-aa226)之间。HBsAg中和性a抗原决定簇在亲水区Ⅱ内，由两对二硫键(分别位于Cys124s-s-Cys137，Cys139-s-sCys147)形成双环(1oop)构型。 S蛋白及其基因虽然相对稳定，但是缺乏细胞免疫刺激表位，免疫原性较弱，因此在保留S基因基础上，补充含有能够刺激TH1方向免疫反应的抗原片段有望提高免疫效果。 preS2基因编码55个氨基酸的PreS2蛋白，是HBV与靶细胞结合的重要蛋白，也是理想的疫苗抗原，PreS2抗原有强的T、B细胞识别决定簇和肝细胞膜及B细胞膜结合的位点，在机体抗HBV感染免疫中起重要作用，实验证实单独用PreS1和PreS2抗原接种均能使其获得抵抗HBV感染的保护性免疫。preS的免疫原性比S强。另外，在preS2序列中没有半胱胺酸(Cys)残基，受立体结构的影响相对较少，利用基因工程表达产物容易模拟PreS2区的若干功能。 由此可见，在保留S基因基础上，补充抗原片段preS2有望提高免疫效果。同时，利用腺病毒载体通过感染呼吸道黏膜将疫苗抗原呈递给机体免疫系统，可避免注射之烦恼。 此外，由于铝佐剂可以强烈刺激机体产生高效的体液免疫反应，却不能刺激机体产生细胞免疫反应，因此，改进佐剂也将提高免疫效果。 目的: 根据上述思路，该课题参考报道文献方法，将乙肝病毒preS2-S基因片段插入腺病毒载体。采用不同佐剂、不同免疫途径、不同免疫时间在BALB/C鼠研究了其体液免疫反应和细胞免疫反应，探讨其在新型HBV疫苗开发中的价值。 方法: 1.重组腺病毒载体的构建 1.1preS2/S基因的克隆根据GenBankHBVadr株preS2/S片段基因序列，设计引物，利用PCR法从“大三阳”乙肝患者血清标本中扩增出目的DNA片段，将PCR产物回收后与pUCm-T载体连接，转化DH5α。挑取阳性菌落，进行DNA序列分析，将测序结果与GenBank发表序列进行同源性分析。 1.2穿梭质粒pShuttlepreS2/S的构建设计带有KpnⅠ和AfⅢ酶切位点的引物PCR扩增preS2/S基因，将PCR产物回收后与pUC-Teasy载体连接，并在DH5α扩增、提取质粒，用KpnⅠ、AflⅡ酶切pKApreS2/S，所得的片段经同样酶切的p-Shuttle穿梭载体连接，转化，筛选。 1.3重组的腺病毒载体的构建提取质粒pShuttlepreS2/S，用PI-SceI、I-CeuI双酶切，回收所需的目的基因片段，回收片段与经同样酶切的腺病毒载体PAdeno-X连接，转化E.coli，筛选，然后进行PCR鉴定并测序确定阳性克隆。 1.4重组腺病毒载体转染HEK293细胞及其preS2/S抗原的检测挑选阳性克隆扩增后，提取重组腺病毒质粒，经PacI酶切纯化后转染HEK293细胞，并用免疫荧光方法检查293细胞是否表达目的抗原。 2.动物试验 2.1预试验将获得的4株重组腺病毒疫苗分别免疫BALB/C小鼠，一个月时观察小鼠的一般情况，用ELISA检测特异性IgG抗体的产生，筛选毒性小而且免疫原性强的重组病毒株。 2.2动物免疫试验将初次筛选出的重组腺病毒分组免疫接种动物，分组为：重组腺病毒组、偶联佐剂重组腺病毒组；空载体病毒对照组和偶联佐剂空载体组。分别经鼻黏膜和皮下注射途径接种SPF级的BALB/C小鼠，并且以空佐剂作为阴性对照、商业疫苗HBsAg铝佐剂阳性对照(也分黏膜免疫途径和皮下免疫途径)。每2周接种1次，共接种5次。于接种疫苗3次后7d用ELISA初次检测小鼠体内特异性IgG抗体的产生，接种5次后7d最终检测诱导体液免疫和细胞免疫的效果。 实验结果: 1.克隆了preS2/S，通过穿梭质粒pShuttlepre将S2/S重组于腺病毒载体，并在HEK293细胞中转染获得了4株表达HBVpreS2/S重组腺病毒，接种重组病毒的293细胞可用免疫荧光检测到preS2/S表达。 2.动物免疫接种预试验4株重组疫苗中N4、N2无毒性且有一定效果(ELISAIgG抗体1：10)；N3血清1：10稀释未测到IgG抗体；N1具有小鼠肠道毒性且免疫效果差(1：10)未测到IgG抗体。 3.动物免疫接种正式试验 3.1三次免疫后2周抗体检测重组腺病毒各组免疫小鼠血清在1：100稀释度均未检测到特异性血清IgG阳性抗体； 3.2五次免疫后1周抗体检测重组腺病毒鼻黏膜组(无佐剂)动物在1：100-1：800均可测得阳性IgG抗体(P/N值≧2.1)。重组腺病毒诱导产生的IgG抗体水平低于重组腺病毒/佐剂组(P＜0.05)；重组疫苗/佐剂组(鼻黏膜接种)诱导小鼠产生抗体水平与商业腺病毒比较无明显差异(P＞0.05)。皮下接种重组腺病毒或重组腺病毒/佐剂在1：100-1：800未测得阳性IgG抗体；各阴性对照组(空载体、空佐剂、二者偶联物)未测得IgG阳性抗体。 3.3细胞免疫检测 3.3.1小鼠NK杀伤活性重组腺病毒(50.9％)刺激机体产生高于常规疫苗(11.8％)的NK杀伤率与常规疫苗组比较P＜0.01。 3.3.2小鼠诱生γ-干扰素和白细胞介素2的检测脾淋巴细胞体外培养后，重组腺病毒组黏膜接种(80pg/ml、89pg/ml)产生了高于商业疫苗组(46pg/ml、34pg/ml、)和正常对照组(40.9、IL-2：28.6)的γ-干扰素和白细胞介素2。 结论: 1.该课题制备的表达HBVpreS2/S的重组腺病毒鼻腔接种可诱导小鼠产生特异性IgG抗体，偶联佐剂可提高其免疫效果，滴度可达到商业疫苗注射途径诱导的IgG抗体水平。 2.重组腺病毒可刺激机体产生细胞免疫反应，重组腺病毒偶联佐剂优于商业疫苗。该结果提示本重组腺病毒作为预防性疫苗具有良好的应用前景，另外具有作为治疗性疫苗的潜在可能性。