银粉背蕨水分胁迫差异cDNA的研究BcWRKYⅡ基因及其5'调控区的克隆

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1.银粉背蕨水分胁迫差异cDNA的研究 银粉背蕨水(Aleuritopteris argentea(Gmel)).它属蕨科粉背蕨属植物,具有典型复苏植物的特性,为了寻找该植物水分胁迫特异表达的基因,从分子水平阐明干旱作用的机理,研究干旱对该植物基因表达的影响。以银粉背蕨成熟孢子经过无菌处理,萌发为原叶体,利用水陪法培养三周,采用Conccert法从富含多糖和酚类物质的银粉背蕨中提取出高质量的RNA作为模板,利用mRNA差异显示技术的优化方法,如银染变性聚丙烯酰胺凝胶、地高辛标记反向Northern中的两个cDNA探针、优化PCR扩增程序等,分离到差异表达的3个阳性片段。从基因表达水平来说,1个在干旱处理后表达水平上调,一个表达水平下调,一个干旱诱导特异表达。测序后进行同源性比较,两个为未知基因,一个为与已知hypothetical protein同源性36%的基因。 2.厚叶旋蒴苣苔BcWRYⅡ基因及5’调控区的克隆 WRKY蛋白为新近发现的植物特有的转录因子家族。已有报道这一基因家族参与多个生理过程,如病原防御,衰老以及表皮毛(trichome)发育。近年来发现WRKY基因也参与植物对逆境胁迫的反应。厚叶旋蒴苣苔(Boea crassifolia)属于苦苣苔科旋蒴苣苔属,为我国特有的物种,十分耐旱,主要分布在我国西南部的具石灰岩地貌的地区。它是一种复苏耐旱的植物,能在极端干旱条件下生存下来。 基于WRKY家族的重要性我们依据WRKY蛋白的保守序列设计引物,利用RT-PCR的方法,用干旱诱导后的厚叶旋蒴苣苔为材料,提取总RNA,克隆了一个WRKY家族新成员BcWRKYⅡ基因的片断。序列分析表明所克隆的该基因属在WRKY家族group3。利用5’RACE技术得到了BcWRKYⅡ基因的全长cDNA。为进一步研究该基因的表达调控,在获得干旱诱导表达的BcWRKYⅡ基因全长cDNA之后,利用接头介导的PCR(LM-PCR)技术,克隆出BcWRKYⅡ基因的908bp的5’调控区序列,为进一步研究WRKY家族基因的转录调控机制研究奠定了基础。
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