目的:肝癌是世界范围内癌症相关死亡的第三大原因,其发病率和死亡率逐年上升,已有的化疗药物毒性较大且治疗效果不佳,亟待开发安全高效的新型治疗药物。淫羊藿素是由中药淫羊藿中提取的黄酮类单体化合物淫羊藿苷水解而成,对肝癌具有较好的治疗效果,目前已进入临床三期研究。但其水溶性差,生物利用度低,有效剂量大,一定程度上限制了其临床应用。本研究将淫羊藿素与葡萄糖偶联,以期增加其溶解度及肿瘤靶向性,对化合物理化性质、制剂进行研究,并考察了化合物体外抗肝癌活性和作用机制。方法:1.淫羊藿素衍生物的制备及表征通过多步化学反应制备葡萄糖衍生物(编号a,b,c),直链二醇及其衍生物的酸酐(编号1-9),通过酯化反应以酸酐取代淫羊藿素上的羟基,再与葡萄糖衍生物进行点击反应,得到目标化合物。并用核磁共振谱对化合物结构进行表征。2.淫羊藿素衍生物纯度及溶解度考察建立了一种纯度测定的高效液相方法,并进行了方法学验证;考察衍生物的稳定性及不同批次制备样品的重复性。以HPLC考察合成得到的产物在水、PBS、生理盐水、0.1%吐温80中的溶解度,同时考察了yyhs-1-b、yyhs-2-a在玉米油、无水乙醇、丙二醇、HS15中的溶解度。3.淫羊藿素衍生物体外抗肝癌活性及机制研究选择人源肝癌细胞Hep G2和SMMC7721作为细胞模型考察合成得到的淫羊藿素衍生物在肝癌细胞上的毒性;选择肝癌细胞Hep G2进行进一步的体外抗肝癌活性研究;选择正常肝细胞LO2进行安全性考察。实验分为:空白对照组、淫羊藿素组、淫羊藿素衍生物组。以MTT法检测细胞活性(给药浓度最大为100μM);通过细胞划痕实验及Transwell实验考察不同给药组处理细胞后的侵袭和迁移率(给药浓度为:6.25,12.50,25μM);通过Hochest 33258细胞核染色法和Annexin V/PI流式细胞术考察给药后细胞凋亡情况及细胞(给药浓度为:6.25,12.50,25μM);以MTT法及平板克隆实验考察细胞增殖(给药浓度为:1.25,2.5,5,10μM);以蛋白印迹法检测Hep G2细胞蛋白表达(给药浓度为:12.50μM)。4.淫羊藿素衍生物体内抗肝癌活性初步考察选择人源肝癌细胞Hep G2作为细胞模型,以雄性Balb/c裸鼠建立肝癌皮下瘤模型,以生理盐水、淫羊藿素、yyhs-1-b、yyhs-2-a进行腹腔给药治疗,给药浓度为:淫羊藿素(Icaritin)10 mg/kg,yyhs-1-b高剂量25.30mg/kg,低剂量12.65mg/kg,yyhs-2-a高剂量22.91mg/kg,低剂量11.45mg/kg,共给药21天,每3天测量裸鼠体重及肿瘤体积并绘制生长曲线。5.淫羊藿素脂质体的制备及表征采用薄膜水化-旋转蒸发法制备脂质体,分别将淫羊藿素及合成得到的yyhs-1-b及yyhs-2-a包载进脂质体中,通过马尔文激光粒度仪,测定脂质体的粒径及电位;以HPLC检测脂质体包封率。结果:1.淫羊藿素衍生物的制备及表征成功制备得到了目标化合物yyhs-1-a、yyhs-1-b、yyhs-2-a、yyhs-2-b、yyhs-3-a、yyhs-3-b、yyhs-4-a、yyhs-4-b、yyhs-4-c、yyhs-5-a、yyhs-5-b、yyhs-5-c、yyhs-5-c、yyhs-6-a、yyhs-7-a、yyhs-7-b、yyhs-7-c、yyhs-8-a、yyhs-8-b、yyhs-8-c、yyhs-9-a、yyhs-9-b、yyhs-9-c。2.淫羊藿素衍生物纯度及溶解度考察通过HPLC对合成的产物纯度进行检测,纯度均大于97%;纯度检测方法学验证得到,RSD值均小于2%,表明:检测方法专属性强,准确度高,重复性良好;淫羊藿素衍生物能够在溶剂中稳定保存12 h,在4℃条件下稳定保存84天,检测结果显示RSD值均小于2%。溶解度测定结果得到,yyhs-1-b、yyhs-2-a、yyhs-5-a、yyhs-5-b、yyhs-5-c、yyhs-8-b、yyhs-9-c的溶解度相较于淫羊藿素明显提高;在玉米油、无水乙醇、丙二醇、HS15中yyhs-1-b、yyhs-2-a的溶解对均大于淫羊藿素2倍左右,表明对淫羊藿素进行结构修饰能够改淫羊藿素的溶解度。3.淫羊藿素衍生物体外抗肝癌活性研究MTT实验结果显示,淫羊藿素的IC50为20.59±2.82μM,在48 h时,yyhs-1-b、yyhs-2-a、yyhs-8-b、yyhs-9-c的IC50分别为:14.86±0.22,10.31±1.19,11.99±0.82,15.05±1.32μM,与淫羊藿素相比,能够明显抑制Hep G2细胞活性;在72 h时yyhs-1-b、yyhs-2-a、yyhs-5-b、yyhs-5-c、yyhs-6-a、yyhs-7-a、yyhs-8-b、yyhs-9-c的IC50分别为:7.09±0.38,7.91±0.98,5.56±0.60,10.11±0.32,11.99±1.23,7.03±0.67,5.56±0.60,7.69±0.04μM,而淫羊藿素为16.05±1.27μM,对Hep G2细胞活性具有明显的增强抑制效果;在48 h时yyhs-1-b、yyhs-2-a(IC50分别为:9.30±0.35,10.31±1.19μM)与淫羊藿素(IC50为23.24±1.02μM)相比,能够明显抑制SMMC7721细胞活性;在72 h时yyhs-1-b、yyhs-2-a、yyhs-2-b、yyhs-5-b、yyhs-7-a、yyhs-8-a、yyhs-8-b、yyhs-8-c、yyhs-9-b、yyhs-9-c(IC50分别为:5.99±0.49,5.823±1.04,2.51±0.72,6.65±1.29,12.68±1.02,5.644±0.65,6.65±1.29,8.68±0.52,12.9±1.03,9.57±1.20μM)与淫羊藿素(IC50为14.96±0.66μM)相比能够明显抑制SMMC7721细胞活性。细胞划痕实验及Transwell试验结果表明,与淫羊藿素组相比yyhs-1-b、yyhs-2-a可显著抑制细胞的侵袭和迁移。Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率,结果显示,yyhs-1-b、yyhs-2-a导致Hep G2凋亡,在25μM时淫羊藿素、yyhs-1-b及yyhs-2-a的凋亡率分别为:47.47±2.85%,23.86±1.26%,21.45±0.47%,在给药12.5μM时的凋亡率分别为41.70±1.91%,18.74±0.40%,17.92±1.16%;在给药6.25μM时的凋亡率分别为:13.45±1.23%,13.67±0.72%,12.30±0.46%;Hoechst 33258染色结果表明,给药处理24 h后,yyhs-1-b、yyhs-2-a组细胞严重受损,细胞凋亡最多。MTT实验表明与淫羊藿素相比yyhs-1-b、yyhs-2-a能够显著抑制细胞增殖,平板克隆实验显示,在给药浓度为10μM时,细胞几乎不增殖,在给药浓度为5μg/m L时,yyhs-1-b的克隆形成率仅为:13.4±1.11%,yyhs-2-a的克隆形成率为:9.33±1.50%。蛋白表达检测发现,yyhs-1-b、yyhs-2-a能够有效促进Hep G2细胞中蛋白Bax、caspase-3的表达,减弱Bcl-2的表达,增强凋亡效果。安全性实验发现,与淫羊藿素组相比,yyhs-1-b、yyhs-2-a、yyhs-5-b、yyhs-8-b、yyhs-9-c具有较高的安全性,在最大给药浓度100μM时正常细胞LO2细胞存活率均大于60%。4.淫羊藿素衍生物体内抗肝癌活性初步考察通过对治疗结束后裸鼠体积进行测量结果显示,给药生理盐水组肿瘤体积为857±132.5 mm3,淫羊藿素组肿瘤体积为:404.05±112.94 mm3;yyhs-1-b低剂量组、yyhs-1-b高剂量组、yyhs-2-a低剂量组、yyhs-2-a高剂量组肿瘤体积分别为:221.88±118.02、38.87±16.57、204.92±48.36、81.84±67.34mm3,与淫羊藿素组相比能够明显抑制肿瘤的增长,尤其是yyhs-1-b高剂量组和yyhs-2-a高剂量组具有较高的治疗效果,体内抗肝癌活性高。5.淫羊藿素及其衍生物脂质体的制备及表征成功制备得到淫羊藿素、yyhs-1-b、yyhs-2-a及空白脂质体,载药脂质体粒径分别为:71.30±0.15,98.80±2.20,90.40±0.74 nm;电位分别为:0.12±0.11,1.74±0.57,1.22±0.62。包封率分别为97.41±1.60%,95.29±1.40%,90.40±1.42%。空白脂质体的粒径电位分别为:60.40±0.94nm,-11±0.53。结论:综上所述,本研究成功合成了一系列淫羊藿素衍生物,并对化合物理化性质进行考察。合成方法简单重复性高,得到的产物纯度高,纯度检测方法具有较高的专属性、准确度及精密度。通过引入葡萄糖基团,有效提高的淫羊藿素的溶解度,提高了其生物利用度,明显提高了淫羊藿素的抗肝癌活性。本课题的研究为肝癌的治疗提供了新的研究方向,具有重大的研究价值。