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本文对一株辛格粒毛盘菌(Lachnum singerianum)进行原生质体诱变,并对突变株Ls-5发酵条件和胞内黑色素的提取、稳定性、生物学活性以及结构进行研究,主要结果如下:
1、L.singerianum原生质体制备的最佳条件为:2％纤维素酶、3％溶壁酶和3％蜗牛酶配制而成的复合酶,酶解温度33℃,酶解时间3 h,在此最佳条件下,原生质体数量可达9.9×106个/mL;紫外诱变的最佳剂量为:20 W紫外灯下30 cm处照射50 s;获得的突变株Ls-5生物量较出发菌株提高26.70％,黑色素产量较出发菌株提高16.87％;
2、Ls-5的最佳发酵条件为:20％马铃薯浸汁、葡萄糖20g/L、酵母膏5.0 g/L、酪氨酸0.01 g/L、硫酸镁0.01 mol/L,、硫酸锰0.001 mol/L,、pH8.0、27℃、发酵8 d;
3、Ls-5胞内黑色素的最佳提取工艺为:NaOH浓度0.8 mol/L、液料比150 mL/g、提取温度80℃、提取时间60 min,此时提取率达到12.05％;经HC1酸解、有机溶剂(乙酸乙酯、氯仿、无水乙醇)萃取后,得到黑色素纯品(8.85g/100g茵丝体);
4、Ls-5胞内黑色素可溶于NaOH、氨水等碱性溶液,不溶于水、HC1及常见有机溶剂(乙酸乙酯、氯仿、乙醇、丙酮、乙醚等);在pH≥7时稳定,pH≤6时产生沉淀;对光(紫外光、自然光)、还原剂(亚硫酸钠)、添加剂(苯甲酸钠、蔗糖、柠檬酸钠)及一些金属离子(Na+、K+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Al3+)稳定,而对过氧化氢、柠檬酸、Vc、Cu2+、Fe3+不稳定;
5、Ls-5胞内黑色素在浓度为200 mg/L时,总抗氧化能力相当于15.85mmol/Lα-生育酚;该黑色素还原能力的EC50值(吸光度为0.5时的浓度)为216.5 mg/L;浓度为200 mg/L时,该黑色素对·OH、DPPH·、O2-·的清除率以及对Fe2+的螯合率分别为52.64％、41.2％、43.48％、45.37％,对应的IC50值(清除率为50％时的浓度)分别为180.87 mg/L、240 mg/L、275.27mg/L、214.7 mg/L,结果表明,Ls-5胞内黑色素具有较强的抗氧化能力;
6、Ls-5胞内黑色素在210 nm处有最大吸收峰,吸光度值在210 nm到800 nm之间呈指数减小趋势,表现出典型黑色素的特征;显微电镜扫描显示Ls-5胞内黑色素呈块状、表面不规则的晶体结构;红外光谱显示该黑色素在3374 cm-1和1639 cm-1处具有真菌黑色素的特征吸收峰,另外在1548 cm-1和1398 cm-1处的吸收峰表明其有黑色素典型的吲哚结构;1HNMR具有脂肪族和芳香族区域的信号峰;13C NMR与真菌黑色素碳谱的特征峰相似。根据ESI-MS推测该黑色素的分子量为535,结合元素分析和红外光谱分析结果,推断Ls-5 IM的分子式可能为C25H33N3O8S。