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天然免疫是机体抵御外来病原微生物侵袭的第一道防线,模式识别受体（PRRs）与病原相关分子模式（PAMPs）之间的相互作用是激活天然免疫的关键。酮戊二酸脱氢酶（Oxoglutarate Dehydrogenas,OGDH）是α-酮戊二酸脱氢酶复合体的E1组件,位于线粒体基质。α-酮戊二酸脱氢酶是三羧酸循环（TAC）中的第三个调节位点,能够催化α-酮戊二酸脱氢、脱羧,生成琥珀酰辅酶A。线粒体是真核生物细胞内提供能量的细胞器,线粒体同时还有多种机制参与信号通路,包括AMP/ATP 比率的改变,活性氧（ROS）和TAC代谢物的释放,以及定位于线粒体外膜的免疫调节蛋白的调控。本研究旨在探究OGDH是否参与Ⅰ型干扰素信号通路及其调控的具体机制,具体内容如下:1.OGDH负向调控IFN-β的产生为了确定OGDH对IFN-β的调控效应,利用慢病毒包装系统获得过表达OGDH的细胞系,在此细胞系上用poly（I:C）处理12 h后收集细胞,通过Western-blot和实时荧光定量PCR评价过表达OGDH对IFN-β的影响。实验结果表明,与对照组相比,过表达OGDH能显著抑制IRF3（interferon regulatory factor 3,IRF3）的磷酸化水平,下调IFN-β和ISG56的mRNA水平。双荧光素酶报告实验结果显示过表达OGDH能显著下调poly（I:C）所诱导的IFN-β的启动子活性。随后我们构建了能有效沉默内源性OGDH的shRNA,同样通过慢病毒包装系统获得沉默OGDH的细胞系,在此细胞系上用poly（I:C）处理12h后收集细胞,通过Western-blot和实时荧光定量PCR评价沉默OGDH对IFN-β的影响。实验结果表明沉默OGDH能上调IRF3的磷酸化水平并且促进IFN-β及ISG56的mRNA水平。双荧光素酶报告实验结果显示沉默OGDH能上调IFN-β的启动子活性。综上所述OGDH负向调控Ⅰ型干扰素的产生。2.OGDH负向调控IFN-β产生的分子机制研究为了找到OGDH参与调控Ⅰ型干扰素所在通路互作的靶蛋白,本研究筛选了该通路中的常见接头分子,利用Co-IP实验确定了 OGDH仅与MITA（mediator of IRF3 activator,MITA）发生相互作用。激光共聚焦实验发现OGDH与MITA存在共定位现象,且定位于细胞质。将重组质粒pCAGGS-HA-MITA和pTRIP-OGDH-3Flag共转染至293T细胞,在此基础上,将仅转染空载体和仅转染pCAGGS-HA-MITA的组作为对照,24 h后收集细胞,随后通过实时荧光定量PCR来评价过表达OGDH对MITA所介导的IFN-β的影响,实验结果表明过表达OGDH能下调MITA所诱导的IFN-β和ISG56的mRNA水平。为了进一步探究OGDH靶向MITA调控干扰素信号通路的具体机制,将重组质粒pTRIP-3Flag/pTRIP-OGDH-3Flag 和 pCAGGS-HA-MITA 分别共转染至 293T 细胞,同时将重组质粒pTRIP-3Flag和pTRIP-OGDH-3Flag分别转染至293T细胞,24 h后收集细胞,western-blot实验结果表明OGDH能有效降解内源性MITA而不影响外源性MITA的表达。为了探究OGDH降解MITA是否具有剂量依赖效应,将不同剂量的重组质粒pTRIP-OGDH-3Flag转染293T细胞,24 h后收集细胞,Western-blot实验结果表明OGDH呈剂量依赖性地降解内源性MITA。为了探究OGDH降解MITA的具体途径,在转染重组质粒OGDH-3Flag的基础上,分别用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂NH4Cl处理细胞,10 h后收集细胞。Western-blot结果显示与对照组相比,溶酶体抑制剂NH4Cl处理组MITA的蛋白水平明显回升,这表明OGDH通过溶酶体途径降解内源性MITA。此外,通过OGDH的截短体的构建,我们发现OGDH的C1 domain（aa601-1023）是介导MITA降解的重要结构域。利用慢病毒包装系统获得沉默OGDH的293T细胞系和A549细胞系,通过Western-blot和实时荧光定量PCR评价下调内源性OGDH对MITA的影响,结果显示沉默内源性OGDH会导致MITA的蛋白水平及mRNA水平均显著上调。除此之外,沉默内源性OGDH能促进MAVS对MITA的招募。但是OGDH不与MAVS竞争结合MITA进而影响MAVS对MITA的招募。3.OGDH对病毒复制的影响本研究分别选择了两种病毒伪狂犬病毒（PRV）以及水疱口炎病毒（VSV）作为研究对象,分别作为DNA病毒和RNA病毒的代表。分别通过Western-blot实验,空斑实验确定了过表达外源性OGDH能显著促进PRV和VSV的复制,沉默内源性OGDH能显著抑制PRV和VSV的复制。本研究表明OGDH能够负向调控IFN-β的产生:OGDH能与接头分子MITA发生相互作用,且OGDH的C1 domain通过溶酶体途径降解内源性MITA,下调OGDH能促进MAVS与MITA之间的相互作用进而影响Ⅰ型干扰素的产生。且OGDH参与调节病毒的复制。