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背景利用哺乳动物细胞系,特别是中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞,进行稳定且高效的转基因表达对于治疗性蛋白的工业化生产至关重要。核基质附着区(matrix attachment region,MAR)作为一种含有不同基序的DNA顺式作用元件,有利于克服基因沉默而增强转基因表达。但目前报道的MAR提高转基因表达的水平尚需提高,其作用机制尚不清楚。目的研究一种新的MAR序列人拓扑异构酶I基因(human DNA topoisomerase I,TOPI)在重组CHO细胞中对转基因表达水平及稳定性的影响并探讨其影响表达的机制。方法1.载体构建和细胞转染:PCR克隆TOPI MAR序列,分别构建含有TOPI MAR序列的三个载体用以表达目的基因EGFP(enhanced green fluorescence protein):TOPI MAR序列位于EGFP表达盒的上游、下游,以及位于表达盒的两侧。将构建的表达载体分别转染CHO-S细胞。2.瞬时表达分析:荧光显微镜观察转染48小时后目的基因EGFP的瞬时表达情况并用流式细胞术进行定量分析。3.稳定表达分析:G418筛选获得多克隆细胞池(cell pool)后,分别在有无G418筛选压力的培养基中传代培养30代,流式细胞术检测EGFP的表达水平。采用梯度稀释法筛选获得单克隆重组CHO细胞株,流式细胞术检测其EGFP的表达水平。实时荧光定量PCR(qPCR)法在分子水平检测目的基因EGFP的拷贝数和mRNA在CHO细胞中的表达水平。4.重组蛋白EPO的表达:克隆促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)基因,构建含有TOPI MAR序列和目的蛋白EPO的表达载体并转染CHO细胞,蛋白质印迹法(Western Blot)检测EPO在重组CHO细胞中的蛋白表达。结果1.成功克隆TOPI MAR序列,并构建含TOPI MAR序列的用于表达目的基因EGFP或EPO的真核表达载体。2.流式检测结果表明不同插入位置的TOPI MAR序列均能提高目的基因EGFP的表达,尤其是当TOPI MAR序列位于表达盒的两侧和下游时表达水平最高。3.长期表达稳定性分析显示,TOPI MAR序列位于表达盒下游时转基因表达的维持率最高。4.qPCR检测结果显示,TOPI可通过增加目的基因拷贝数和mRNA的表达而提高转基因表达水平。5.Western blot检测结果表明,TOPI MAR序列插入表达载体的表达盒下游可显著提高目的蛋白EPO的表达水平。结论1.含MAR序列TOPI的表达载体可提高重组CHO细胞中转基因的表达水平及表达的稳定性。2.目的基因的拷贝数和mRNA表达水平以及TOPI插入的位置效应是影响TOPIMAR提高转基因表达的主要因素。