近年来,随着高通量测序技术的广泛应用和多种物种全基因组测序的完成,使得构建高通量、复杂、完整的蛋白间互作网络成为可能,酵母双杂交技术作为研究蛋白质相互作用的主要方法,经过多年的发展,在向着精确化、自动化、规模化、高通量的方向发展。但是迄今为止,酵母双杂交还不能进行文库对文库的大规模筛选工作,无法满足大规模互作网络研究的需要。结核是一种危害严重的传染性疾病,目前,受限于大规模蛋白互作网络研究规模小、通量低,使得对结核杆菌中大量蛋白质相互作用的研究难以展开。结核分枝杆菌作为一种胞内寄生菌,若治疗性抗体等能进入到细胞内发挥作用,必能对疾病的攻克起到举足轻重的作用。而纳米抗体本身具有表达稳定、分子量小、渗透性强等多种优点,本课题构建了一套依托于phiC31/att整合酶的新型高通量酵母双杂交体系,以此为研究基础,以结核分枝杆菌为研究对象,构建结核分枝杆菌中蛋白质之间相互作用的网络图谱。用上述构建的新型高通量酵母双杂交系统对几种结核杆菌抗原蛋白筛选互作羊驼抗体,以期用于结核病的诊断、治疗。本研究获得以下结论:1.构建新型高通量酵母双杂交体系重组载体整合酶Integrase phiC31(En)具有整合功能,能识别特异核苷酸序列ATTP和ATTB,并将特异核苷酸序列及其紧邻的核苷酸序列进行特异性的定向重排,连接成一段新的序列。我们将整合酶Integrase PhiC31序列和其识别的特异核苷酸序列ATTP 和ATTB 分别插入 Matchmaker GAL4 系统的载体 pGADT7 和pGBKT7(Clontech)中,构建新型高通量酵母双杂交体系重组载体pGADT7-ATTP-phiC31(简称 pmGADT7)和 pGBKT7-ATTB-phiC31(简称 pmGBKT7)。2.新型高通量酵母双杂交体系的阳性互作蛋白验证将Matchmaker GAL4系统中的阳性对照SV40 large T和小鼠p53蛋白分别克隆进重组载体pmGADT7和pmGBKT7中,观察阳性对照中蛋白表达情况与pGADT7-T和pGBKT7-p53相同,phiC31的整合效率几乎达到100%,阳性实验组互作情况和对照组相同,从而证明此方法在已知阳性互作蛋白上可用。3.运用新型高通量酵母双杂交体系构建结核分枝杆菌蛋白间的互作网络图谱构建结核分枝杆菌H37Rv株的膜蛋白、分泌蛋白、脂蛋白的诱饵文库和猎物文库,运用新型高通量酵母双杂交技术直接进行诱饵文库对猎物文库的杂交筛选,构建结核分枝杆菌蛋白之间的互作网络图谱,证明新型高通量酵母双杂交体系在蛋白互作组学中的可行性。4.构建半人工合成羊驼抗体蛋白猎物文库,筛选与结核蛋白互作的羊驼抗体ESAT6、CFP10、Ag85、HSPX是结核分枝杆菌的四种重要的抗原蛋白,利用同时表达这四种蛋白的AAV病毒,感染动物并获得针对这四种抗原的特异性抗体。从而获得对结核特异性CDR3区核酸序列。人工合成羊驼抗体FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、FR4核酸序列,并和上述获得特异性抗体的CDR3区核酸序列融合,构建半人工合成的羊驼抗体猎物文库,并筛选针对这四种结核分枝杆菌重要抗原蛋白的互作羊驼抗体。