人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus,h RSV）是引起5岁以下婴幼儿出现严重下呼吸道感染的主要病原体之一,严重时可导致婴幼儿死亡。老人和免疫缺陷人群也是RSV感染的高危人群。疫苗接种是预防病毒性疾病最有效的措施,截至目前仍没有安全有效的RSV疫苗上市。反向遗传操作技术的建立和应用,极大地促进了对RNA病毒基因组结构与功能和病毒致病机制的研究,为基于病毒基因组修饰改造的基因工程活疫苗的构建提供了技术支撑。为了构建人呼吸道合胞病毒A2株的反向遗传操作系统,本论文以RSV A2株为材料,首先构建了检测反向遗传操作系统中RSV基因组RNA复制与转录情况的链特异性（Strand-specific）荧光定量RT-PCR检测方法。该方法可以区分和定量检测cRNA和vRNA链。针对RSV的F基因设计合成了两条带有标签的特异性引物进行RT-PCR,引物由一段与RSV基因无关的标签tag1或tag2连接一段vRNA或cRNA的互补序列组成。然后使用与逆转录引物中的标签部分相同序列作为正向引物,与不同RNA链互补序列作为反向引物进行荧光定量PCR检测。利用标准质粒构建得到的标准曲线显示在10~1～10~7 copies/μL间具有良好的线性相关性,对cRNA和vRNA的最低检测限度均为10 copies/μL,该方法具有较高的特异性、灵敏性和可重复性。RSV感染Hep-2细胞72 h后检测到vRNA的拷贝数约为3.15×10~6 copies/μg,cRNA的拷贝数约为1.09×10~6 copies/μg。本方法能够区分和定量检测出vRNA链和cRNA链,这为研究RSV的复制、转录机理提供了新的方法。以RSV A2株为材料,提取RNA进行RT-PCR,以cDNA为模板分段扩增基因组片段,采用酶切连接、In-Fusion克隆等克隆策略,将RSV A2株基因组全长cDNA克隆至pAC质粒载体,在leader序列和NS1基因间插入了绿色荧光蛋白（GFP）报告基因,在重组质粒cDNA上游插入T7启动子,下游插入锤头状核酶和T7终止子,利用T7启动子表达系统实现RSV反基因组的转录。同时构建了N、P、L和M2-1蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P、pcDNA3.1-L和pcDNA3.1-M2-1用作RSV拯救所必需的四个辅助质粒。为了评价辅助质粒编码蛋白的功能,构建含GFP报告基因的微基因组质粒pAC-T7-GFP,将pAC-T7-GFP质粒和四个辅助质粒共转染Hep-2细胞,接种痘病毒vTF7-3提供T7聚合酶。转染后72 h能观察表达GFP的荧光细胞,表明辅助质粒具有功能活性。同样地将载有RSV基因组全长cDNA质粒pAC-T7-RSV/GFP与四个辅助质粒共转染Hep-2细胞,接种痘病毒vTF7-3提供T7聚合酶进行RSV的拯救,经荧光显微镜观察证实能够观察到绿色荧光。荧光定量RT-PCR检测结果显示,转染细胞中能够检测到RSV的vRNA和cRNA存在。这些工作为后续研究RSV的基因组结构与功能和构建RSV基因工程疫苗奠定了基础。