研究背景:创面修复是当前困扰创伤骨科临床的几大难题之一,并随着社会发展和人口老龄化,创面的发生率和复杂性具有日益增高的趋势。近年来,各种针对创面治疗的新型生物活性材料层出不穷,为解决复杂的创面愈合难题带来了许多新理念和新思路,但仍然无法形成统一认识以及在临床上进行大规模临床试验。研究表明:以干细胞为基础的组织工程皮肤在促进创面修复方面已经取得了显著成果,但由于目前常用的干细胞来源多为骨髓间充质干细胞、脂肪来源性干细胞、胚胎源性干细胞等,但这些干细胞类型都存在着提取过程痛苦、移植规模受限的问题,个别种类还存在着一定的伦理争议。近年来,一种从尿液中从提取干细胞的方法获得了广泛关注和认可。这种尿液源性干细胞具备干细胞的各种再生分化和组织修复能力,而且来源广泛、提取方法简单。既可以源源不断地为组织修复提供个体化的原材料,又可以完全避免给患者带来任何痛苦。随着干细胞移植研究的深入,研究者已达成了一个共识:就是干细胞的修复功能更多的是通过其自身的旁分泌效应作用于移植部位的受体细胞来实现。这一理念要求研究者必须由局部视角转换为整体视角,即:我们不应当仅仅把干细胞视为受损组织的替代品,而应当将干细胞和受体细胞视为一个紧密相关的有机整体。为此,我们构建了一种生物活性材料—硅酸盐生物玻璃(Bioglass,BG),前期研究已证实:这种生物活性材料可以极大地增强干细胞的旁分泌效应。但这种效应是否同样存在于尿源性干细胞和皮肤受体细胞之间仍属未知。因此,我们构建了两者之间的细胞共培养模型,并将BG离子激活后的尿源性干细胞移植到创面周围,尝试探索一种治疗创面的尿源性干细胞移植新方法。除了关注于创面内部的细胞层面,我们还需要着眼于创面外部的屏障环节,因为皮肤本身最重要的功能就是作为机体和外界之间的屏障。水凝胶是一种以水为分散介质的具备网格状交联结构的高分子聚合物,常见的水凝胶如透明质酸、纤维蛋白胶、壳聚糖等,传统水凝胶虽然具有良好的组织相容性,但其存在的最大缺陷就是难以有效而持久地和创面进行整合。本研究以一种新型的具有优良的生物相容性和优异的组织整合性的光致亚胺胶连水凝胶(Phototriggered Imine Crosslink,PIC)为载体,使用临床上获取来源广泛且应用潜力巨大的人脐带血富血小板血浆(PRP)为生长因子来源。尝试构建一种可以紧密牢固结合在创面表层,既可为创面提供屏障又可缓释各种生长因子的新型水凝胶材料。以期由内而外地为临床解决创面修复难题提供一种新的策略和方法。研究内容和方法:1、以尿源性干细胞为对象,通过对条件培养基内各种生长因子的测定以及细胞生长状态的检测,筛选出BG离子最佳诱导浓度。进而构建尿源性干细胞和内皮细胞、成纤维细胞的间接和直接接触共培养模型,再一步构建涉及三种细胞直接接触共培养模型。最后,通过对共培养体系内细胞基因表达和蛋白合成的检测,评估BG离子对尿源性干细胞和受体细胞之间旁分泌效应的影响。2、首先,使用BG离子在体外和尿源性干细胞共同培养三天,然后在裸鼠皮肤创面模型上进行尿源性干细胞移植,最后通过组织学染色、免疫组化染色等方法,评估BG诱导后的尿源性干细胞对裸鼠皮肤创面的修复作用和相关机制。3、通过两步法提取新鲜脐带血PRP后,将有效成分为经光敏基团邻硝基苄醇(o-Nitrobenzyl alcohol,NB)修饰的透明质酸(HA-NB)的水凝胶以一定比例混合其中,构建HNPRP,通过流体力学测试、电子扫描显微镜扫描、负载生长因子长效缓释、体外细胞划痕试验等方法评估HNPRP的理化性质。进而在使用STZ诱导的糖尿病大鼠难治性创面模型上检验HNPRP的修复功能,通过对创面组织学染色、免疫荧光染色等方法,探讨HNPRP对大鼠难治性创面的修复能力和相关机制。研究结果:1、BG离子可以显著提高尿源性干细胞和皮肤受体细胞间的旁分泌效应:(1)在1/128稀释比例下,BG离子可以获得对尿源性干细胞最佳的激活效果;(2)在尿源性干细胞-内皮细胞共培养体系中,BG离子的加入可以增强内皮细胞KDR、VEGF、VE-cad的表达;(3)在尿源性干细胞-成纤维细胞间接共培养体系中,BG离子的加入可以增强成纤维细胞Collagen-1、fibronectin以及α-SMA的表达;(4)在三种细胞共培养体系中,BG离子的存在同样可以增强内皮细胞KDR、VEGF、VE-cad的表达,但仅增强了成纤维细胞Collagen-1和fibronectin的合成。3、HNPRP可以有效缓释脐带血PRP中的生长因子并显著促进了糖尿病大鼠皮肤创面的修复:(1)HNPRP可以缓释生长因子长达28天;(2)HNPRP具备创面修复所需要的理想的溶胀性和组织相容性:(3)HNPRP可以促进创面上皮迁移、血管新生和成熟以及肉芽组织内胶原纤维的分泌。结论:1、BG离子可以显著提高尿源性干细胞和皮肤受体细胞间的旁分泌效应。进而增强了内皮细胞的成血管能力,促进了成纤维细胞基质蛋白的合成和分泌。2、BG离子可以显著提高尿源性干细胞的创面修复能力,其具体机制是:经BG离子激活后的尿源性干细胞,通过旁分泌效应显著增强了创面内皮细胞和成纤维细胞的活力,进而改善了创面的血供、增加了胶原蛋白的沉积,最终加快了创面愈合。3、HNPRP是一种理想的创面修复材料,其修复机制是HNPRP可以有效缓释生长因子并能够充分促进创面上皮迁移、血管新生和成熟以及肉芽组织内胶原纤维的分泌。