棉花(Gossypium hirsutum)干旱应答的转录组分析及DRPP1基因在棉花抗旱中的功能研究

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干旱是影响植物生存、生长和分布的最重要的非生物胁迫之一。据估计,全球由于缺水而导致的农作物减产占所有环境因素导致的作物减产的50%以上。棉花是世界上最主要的经济作物之一,由于我国新疆及长江流域(特别是湖北、湖南、江西等省)夏秋时节经常晴热少雨,伏旱的发生比较频繁,造成棉花水分供需失调,叶片萎蔫,植株生长发育受阻,棉铃脱落严重,对棉花的产量和品质影响非常大。因此,研究提高棉花的抗旱性,对于我国棉花产业的稳定发展极其重要。蛋白的可逆磷酸化在各种信号转导中起着非常重要的作用,调控着真核生物中大多数的生物学过程。蛋白激酶(PK)和磷酸酶(PPs)对于细胞在正常和逆境条件下磷酸化状态的维持是非常关键的。已有研究发现蛋白磷酸酶对生物体内的有关代谢起着重要的调节作用。其中,PP2C蛋白磷酸酶在调控细胞周期、胁迫信号转导、基因转录、蛋白质翻译及翻译后修饰等细胞活动过程中发挥重要的作用。在植物中,除了报道较多的A类PP2Cs外,其他类别的PP2C也在植物发育和抗逆性方面发挥重要作用。作为植物体内较大的一类蛋白磷酸酶家族,PP2C具有特殊的结构特征和理化性质,并参与植物体内多种信号途径,而植物体内PP2C家族蛋白的多样性则表明其在不同的组织和器官中信号转导机制的多样性。但是,要清楚地了解PP2C蛋白的分子功能和作用机制是一项艰巨的工作。而且,在PP2C蛋白磷酸酶在植物抗逆过程中的直接作用底物的研究方面,目前仍然不是很清楚,特别是棉花中关于PP2C功能的报道极少。因此,对于PP2C蛋白在棉花抗逆中的功能研究具有重要理论意义和应用价值。利用转录组测序技术等方法,本文对两个具有不同抗旱性的棉花品种在干旱胁迫下的叶片转录组进行了比较分析,发现有许多基因在干旱胁迫下差异表达。在上调表达的基因中,鉴定了一个编码PP2C蛋白的基因,命名为GhDRPP1(DroughtRelatedPP2C1)。利用过量表达和基因沉默的技术方法,本文对GhDRPP1在棉花干旱应答过程中的功能及作用机制进行了研究,获得以下主要结果:1.抗旱品种晋棉13号和干旱敏感品种鲁棉6号在干旱胁迫下的比较转录组分析采用RNA-Seq技术对抗旱品种晋棉13号和干旱敏感品种鲁棉6号在干旱处理时期的叶片进行比较转录组分析。差异表达基因的统计结果显示,在干旱胁迫下大约有13.38%~18.75%Unigene的表达发生了变化,与对照相比,晋棉13号植株中差异表达基因的数量随着干旱处理时间增加而增加;GO功能聚类分析显示,很大一部分差异表达基因涉及到代谢、运输、防御应答、蛋白质修饰、激素信号应答等生物学过程,这表明干旱胁迫影响棉花的生长发育和代谢过程;对晋棉13号在整个干旱时期的差异表达基因进行共差异表达分析时发现,与对照组相比,晋棉13号有627个基因持续上调表达,229个基因持续下调表达,这说明持续的干旱胁迫引起细胞内一些特定的基因表达变化来调控棉花抗旱应答过程;细胞壁合成、非生物胁迫应答、ABA信号应答、碳水化合物的合成与代谢等相关基因在干旱处理的整个过程中都富集性高表达,而乙烯信号通路相关基因富集性低表达,暗示了晋棉13号可能通过激活ABA信号通路和其他代谢通路相关基因的表达来抵御干旱胁迫。干旱处理6 d的晋棉13号和鲁棉6号之间的差异表达基因的统计结果显示,大约一万多个基因发生了差异表达;与鲁棉6号相比,非生物胁迫应答、细菌防御应答、葡萄糖转移酶、ABA信号应答等相关基因在晋棉13号中富集性高表达,乙烯、茉莉酸合成与代谢通路等相关基因低表达,暗示了这些信号通路可能参与棉花对干旱胁迫的响应及耐受性。2.GhDRPP1基因的克隆鉴定及表达分析通过上述转录组分析,从棉花中分离鉴定了一个PP2C家族基因,命名为GhDRPPl(CotAD18479)。表达分析结果显示,GhDRPP1在棉花各组织中均有表达,并且该基因在棉花叶片和根中的表达受ABA、甘露醇、NaC1的强烈诱导;在干旱处理时期,GhDRPP1在晋棉13和鲁棉6号的棉花叶片中都显著上调表达。干旱处理3 d和5 d时,晋棉13中GhDRPP1基因的表达量要高于鲁棉6号,这表明GhDRPP1是一个受干旱胁迫诱导的基因,可能参与棉花干旱胁迫的应答过程。3.GhDRPP1编码一个PP2C蛋白磷酸酶GhDRPP1蛋白比对和进化分析的结果显示,该蛋白可能是一个PP2C蛋白磷酸酶。亚细胞定位结果显示,该蛋白定位在细胞核中;构建了 MBP-GhDRPP1的融合表达载体,在体外对GhDRPP1蛋白磷酸酶的活性进行了测定分析,结果显示该蛋白具有PP2C蛋白磷酸酶的活性。4.过量表达GhDRPP1导致转基因拟南芥对干旱敏感构建了 GhD/RPP1过量表达载体,转化拟南芥,获得转基因植株。对转基因拟南芥在ABA和甘露醇处理条件下种子萌发率和绿苗率进行了分析,结果显示ABA处理条件下转基因拟南芥种子萌发率和绿苗率要高于野生型,而甘露醇处理条件下种子萌发率和绿苗率要低于野生型,说明GhDRPP1过量表达导致拟南芥对ABA不敏感和对甘露醇敏感;转基因拟南芥干旱处理后的表型观察结果显示,干旱处理20 d后GhDRPP1过量表达转基因拟南芥出现萎蔫现象,而野生型拟南芥植株生长状态良好;干旱23 d后对植株进行复水,并对复水2 d后植株的成活率进行统计分析,结果显示转基因植株的成活率显著低于野生型,上述结果说明GhDRPP1的过量表达增加了拟南芥对干旱的敏感性,导致植株不耐旱。对ABA和甘露醇处理条件下的GhDRPP1过量表达转基因植株中ABA和胁迫应答相关基因的表达进行分析,结果显示在ABA和甘露醇处理后,转基因植株中RD22、COR15、NHX1、CBF3基因的表达量均显著低于野生型。这些结果暗示了 GhDRPP1过量表达植株对干旱敏感的表型可能是由于ABA和逆境胁迫应答相关基因的下调表达所引起的。5.GhDRPP1在棉花干旱应答过程中发挥重要作用构建了GhDRPP 过量表达载体和基因沉默(RNA干扰)相关载体,分别转化棉花,收获T1和T2代种子后,分别对T1和T2代转基因棉花表型进行了分析,结果显示GhDRPP1的过量表达棉花植株相对于野生型干旱敏感,而GhDRPP1RNAi棉花植株相对于野生型更加耐旱。生理指标的测定结果显示,在干旱处理条件下GhDRPP1的过量表达棉花植株中的MDA和H202的含量都高于野生型,而GhDRPP1RNAi棉花植株中的MDA和H202的含量都低于野生型,说明GhDRPP1的过量表达植株受到干旱胁迫的影响更加严重;相反,植物体内的清除ROS相关的保护性酶的酶含量(如SOD、POD等)在GhLDRPR1RNAi植株中高于野生型,而在GhDRPP1过量表达植株中低于野生型,脯氨酸含量的测定也得到类似结果,这说明GhDRPP1RNAi植株耐旱能力的提高可能是由于增强了这些ROS清除酶含量和脯氨酸含量的原因;另外,胁迫应答相关基因(如GXH-PX8、GST8、RD22、KIN10等)的表达在GhDRPP1RNAi植株中高于野生型,而在GhDRPP1过量表达植株中低于野生型,这些结果说明,GhDRPP1RNAi植株可能通过增强胁迫相关基因的表达来抵御干旱胁迫。6.GhDRPP1互作蛋白的筛选及相互作用分析为了研究GhDRPP1在棉花抗旱中的作用机制和分子功能,构建了干旱胁迫下棉花叶片的酵母双杂交cDNA文库,以GhDRPP1为诱饵蛋白筛选互作蛋白。发现在所筛选出的23个候选蛋白中,有两个感兴趣的GhDRPP1的互作蛋白,它们与GhDRPP1在棉花抗旱中的功能有待进一步深入研究。此外,酵母双杂交实验结果显示,GhDRPP1与GhPYL蛋白相互作用具有选择性。
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