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传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)感染引起的一种急性、高度接触性传染病。该病主要侵害3-6周龄雏鸡及青年鸡,使鸡群发病、死亡,同时病毒侵害鸡法氏囊B淋巴细胞,导致机体免疫抑制,诱发鸡群疫苗免疫失败,并对其他疾病的易感性增加,出现继发感染或混合感染。因此,传染性法氏囊病被认为是目前严重危害养鸡业的重要传染病之一。本研究利用分子生物学技术成功获得了GST-VP2和GST-VP3的可溶性重组蛋白,并以此表达产物建立了检测IBDV抗体的ELISA方法；同时,应用IBDV-JS株感染SPF鸡,制备了IBDV抗原和阳性血清,并对抗原和抗体进行了一系列的鉴定和标定,获得了相关标准抗原和标准血清,为IBDV的诊断提供了有效的方法和材料。1.检测IBDV抗体ELISA方法的建立本研究根据IBDV-JS株的序列,分别设计了VP2和VP3基因的特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)方法对VP2和VP3基因的全长进行了扩增,然后将目的片段经双酶切克隆至表达载体pGEX-6p-1,并转化BL21(DE3)感受态细菌,挑取阳性细菌克隆送公司测序鉴定。测序正确的pGEX-6p-1-VP2和pGEX-6p-1-VP3经IPTG诱导表达后,十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析诱导表达产物,结果发现当IPTG终浓度分别为0.75mM和0.25mM时,细菌裂解上清中GST-VP2(约80KDa)和GST-VP3(约52KDa)的表达量最高。蛋白免疫印迹试验(Western-Blot)结果显示GST-VP2和GST-VP3重组蛋白均与IBDV阳性血清反应,表明重组蛋白具有良好的抗原性。将纯化后的重组蛋白GST-VP2和GST-VP3分别作为包被抗原,建立检测IBDV抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。通过实验条件的优化,确定VP2, VP3抗原最佳包被量分别为5μg/ml,0.625μg/ml,待检血清最佳稀释度为1：400,最佳孵育时间为30 min,酶标二抗最佳孵育时间为30min,底物最佳显色时间为15min。用建立的ELISA方法检测50份SPF鸡阴性血清,以确定阳性临界值：对基于VP2重组融合蛋白建立的ELISA方法,当OD650>0.12时,判为阳性；对基于VP3重组融合蛋白建立的ELISA方法,当OD650>0.136时,判为阳性。交叉反应性实验证明本研究建立的抗体ELISA检测方法仅与IBDV阳性血清反应,与IBV、ILTV、MDV、ALV、EDSV、AIV-H9、NDV、REV、GPV等阳性血清均不反应,特异性良好。该方法的批内和批间的变异系数均小于10%,说明该方法可行、重复性好。用已建立的2种IBDV抗体检测ELISA方法检测采集自江苏地区的77份鸡血清样品,并与IDEXX公司以及BioChek公司的IBDV抗体检测试剂盒检测进行比较。结果VP2蛋白建立的ELISA与两种商品化试剂盒的检测符合率分别达到94.8%和96.1%；VP3蛋白建立的ELISA与两种商品化试剂盒的检测符合率仅为58.44%和59.7%。比较结果表明,用VP2蛋白建立的ELISA方法更适用于临床样本的检测。2.鸡传染性法氏囊病病毒标准抗原、标准血清的研制本研究使用IBDV-JS株经泄殖腔、点眼感染28日龄SPF鸡,无菌取病死鸡法氏囊组织进行研磨,通过离心和葡聚糖凝胶层析进行病毒纯化,对纯化的病毒抗原含量进行了标定。纯化后的病毒进行PCR鉴定、纯粹性鉴定、琼扩效价测定以及Western-blot分析,结果显示纯化后的IBDV不含IBV、ALV、REV、GPV、MDV、ILTV、AIV、NDV、EDSV等外源性病毒；琼扩效价为1：16；Western-blot试验结果显示纯化的病毒能与抗VP2蛋白的单抗反应。纯化的病毒经灭活后,分装冻干,检查冻干品物理性状,计算装量差异系数(CV),并进行支原体检验、无菌检验、灭活前后以及冻干前后琼扩效价、稳定性、均一性以及长期保存等一系列特性的标定,最终研制出鸡传染性法氏囊病标准阳性抗原。以低剂量IBDV-JS株免疫接种14日龄SPF鸡,经过两次加强免疫后,再以强毒(经泄殖腔、点眼感染)攻击,攻击后12天,静脉试血,效价合格后心脏采血,分离血清,并对血清的特性进行测定。琼扩试验结果显示制备的多抗血清效价为1：128；Western-blot试验结果显示制备的多抗血清与IBDV-JS株、IBDV-Q株反应时均出现两条特异性条带,分子量分别约为30kD和65kD；试验结果显示制备的抗IBDV血清IFA效价为1：1600、ELISA效价为1：51200；免疫荧光试验(IFA)与血凝抑制试验(HI)证明该多抗血清与ALV、REV、MDV、EDSV、NDV、IBV、AIV等其他禽源病毒无交叉反应,特异性良好。对制备的阳性血清进行标定后,加入万分之一硫柳汞防腐剂,分装冻干,检查冻干品物理性状,计算装量差异系数值(CV),并进行支原体检验、无菌检验、防腐剂添加前后以及冻干前后琼扩效价、稳定性、均一性以及长期保存等一系列特性的标定,最终研制出鸡传染性法氏囊病标准阳性血清。