【摘 要】
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研究背景:阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease,AD）是一种以进行性记忆下降,认知功能减退以及行为改变为主要临床表现的神经退行性疾病。许多研究表明,β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）参与了AD的主要病理进程。Aβ过度沉积和Tau蛋白过度磷酸化可产生脑内细胞外老年斑（senile plaque,SP）,导致神经原纤维缠结和大量神经元丢失。AD病理在认知缺陷出现的多年前就可能发
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研究背景:阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease,AD）是一种以进行性记忆下降,认知功能减退以及行为改变为主要临床表现的神经退行性疾病。许多研究表明,β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）参与了AD的主要病理进程。Aβ过度沉积和Tau蛋白过度磷酸化可产生脑内细胞外老年斑（senile plaque,SP）,导致神经原纤维缠结和大量神经元丢失。AD病理在认知缺陷出现的多年前就可能发生,轻度认知障碍（MCI）是介于认知正常和痴呆之间的一种中间阶段,即患者的认知功能存在轻度损害,但未达到痴呆诊断标准,据统计每年约有10%～15%的MCI患者转化为AD。因此,寻找AD的早期诊断生物标志物对于AD早期诊断意义重大。目前,脑脊液水平的Aβ作为诊断AD的重要标准已被写入指南,但是样本采集往往会给患者造成一定的创伤和极大的心理负担,也不适用于大规模的筛查;所以,亟需一种可用于常规临床检测及大规模筛查的诊断标志物。但目前常规的方法学（化学发光,ELISA等）很难对外周血中极低量的Aβ做到精确定量检测,所以需要开发灵敏度更高的检测方法学。研究方法:本研究构建了一种基于滚环扩增和免疫化学发光（RCA-CLIA）的超灵敏检测平台,能够快速高效的对外周血Aβ42/Aβ40进行定量检测。1.滚环扩增-免疫化学发光（RCA-CLIA）检测方法学的建立及优化:我们分别将生物、AE以及primer对兔抗人Aβ42/Aβ40多克隆抗体（primer-anti-Aβ42/Aβ40）进行了标记,并对其标记效果进行了验证;分别制备了DNA环状模板和AE标记的DNA探针（probe）;通过探究不同浓度的捕获抗体（bio-anti-Aβ42/Aβ40）、检测抗体（primer-anti-Aβ42/Aβ40）;AE探针、鲑鱼精DNA、超声时间、磁珠的用量,选出最佳实验用量;我们还进一步对RCA的反应时间进行了优化,确定了最佳反应时间。2.滚环扩增-免疫化学发光检测（RCA-CLIA）方法学的性能评价:分别对RCA-CLIA方法学的线性范围、最低检测限、正确度、精密度、抗干扰性等方面进行评价。3.外周血Aβ42/Aβ40定量检测在AD无创诊断中的应用。研究结果:1.本研究成功建立了外周血Aβ42/Aβ40 RCA-CLIA定量检测方法学,该方法学的线性范围分别为3.9-180pg/m L（Aβ40）和3.9-140pg/m L（Aβ42）;其校准曲线方程分别为RLU=11710X+103118（Aβ40）,R~2=0.9970和RLU=14543X+76295（Aβ42）,R~2=0.9967。最低检测限分别为3.14（Aβ40）和1.99（Aβ42）。批内精密度分别为分别为1.87%、3.23%、8.73%（Aβ40）和1.40%、3.53%、12.61%（Aβ42）。批间精密度分别为2.67%、3.74%、9.74%（Aβ40）和2.67%、4.17%、14.13%（Aβ42）。正确度分别为98.65%（100pg/ml）、95.80%（50pg/ml）、94.28%（25pg/ml）、94.40%（12.5pg/ml）（Aβ40）和108.90%（100pg/ml）、109.88%（50pg/ml）、99.52%（25pg/ml）、95.44%（12.5pg/ml）（Aβ42）。抗干扰结果分别为:Aβ40系统与不同浓度的Aβ42、APP无交叉反应,Aβ42系统与不同浓度的Aβ40、APP无交叉反应。上述结果表明,RCA-CLIA检测方法学具有灵敏度高、特异性好、精密度高、正确度高、重复性好等优点。2.外周血Aβ42/Aβ40定量检测对AD无创诊断的研究。使用RCA-CLIA方法定量检测21例AD患者和22例健康体检者外周血中Aβ42/Aβ40的浓度。结果显示AD患者外周血Aβ40浓度无明显差异、Aβ42浓度明显降低,但后续分析数据结果表明Aβ40单指标分析ROC曲线下面积为0.5130,Aβ42单指标分析ROC曲线下面积为0.7208,两指标结合分析Aβ42/Aβ40的ROC曲线下面积为0.8496,两指标结合可以更好的对AD患者和健康人进行区分。结论:本课题成功构建了基于RCA-CLIA检测外周血Aβ42/Aβ40的方法学,各项方法学指标均可满足临床检测要求;初步临床试验结果表明,该方法对AD无创诊断具有良好的应用前景。
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