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蛋白降解有溶酶体途径和泛素-蛋白酶体途径。其中泛素-蛋白酶体通路参与机体很多生理过程,在神经性病变、炎症演变、糖尿病等疾病的发病机制方面发挥其重要作用,与恶性肿瘤发生发展也有密切关系。最近研究表明,与泛素-蛋白酶体通路相关的蛋白酶体已成为重要的药物作用分子靶点。蛋白酶体抑制剂是一类新型有效的抗肿瘤药物,通过抑制蛋白酶体活性、扰乱和影响肿瘤细胞原有的功能从而抑制肿瘤细胞生长,诱导细胞凋亡。近年来,随着越来越多的蛋白酶体抑制剂的相继研发,其药理作用机制也被不断探索,但毒副作用、耐药等缺陷限制了其临床应用,因此寻找高效低毒、能克服耐药的新型蛋白酶体抑制剂成为近年来首要目标。本文保留了蛋白酶体抑制剂Bortezomib的短肽,引入硫脲作为活性功能基团,以具有高度选择性和潜在抑制效果为目标,设计合成了 29个蛋白酶体靶向末端功能化硫脲二肽6a-6z和7a-7c,运用HR-MS,1H NMR和13C NMR等分析测试手段对化合物结构进行表征。通过MTT法测试所有化合物对前列腺癌细胞T24,肺癌细胞Spca-2,卵巢癌细胞SKOV-3,人大细胞肺癌细胞NCI-H460,人肝癌细胞HepG2,人胃癌细胞MGC-803等6种恶性肿瘤细胞株进行体外增殖的抑制作用,对NCI-H460/DOX和HepG2/DOX耐药细胞株进行逆转药物多药耐药性功能检测,以及通过正常肝细胞HL-7702检测化合物的毒性。实验结果表明合成的大多数硫脲二肽具有良好的抗肿瘤能力,大部分化合物的IC50显著低于上市药阿霉素。尤其是化合物6k对癌细胞NCI-H460表现出较强的抗肿瘤活性,其IC50值达到了 1.70±1.16μM。构效关系研究表明,对于大多数硫脲二肽化合物的末端芳基取代基同时为强吸电子基团时具有较强的细胞毒性。体外20S蛋白酶体酶活性抑制测试结果表明硫脲二肽化合物对人体20S蛋白酶体的糜蛋白酶(ChT-L)具有良好的选择性抑制活性。分子对接分析结果表明硫脲骨架和硝基基团与蛋白酶体间通过氢键形成紧密的相互作用关系,在抑制蛋白酶体活性方面起到重要作用。基于以上结果,以化合物6k为代表,我们研究了化合物对NCI-H460细胞株的作用机制。本论文分别利用流式细胞分析(FITC Annexin V/PI凋亡实验)与荧光染色法(Hoechst33258染色和JC-1荧光染色)实验,证实了化合物6k主要通过诱导NCI-H460细胞凋亡而抑制该癌细胞生长。采用ROS检测实验,钙离子检测实验对其机制进行了进一步的深入研究。ROS与钙离子检测实验表明,加药后,细胞间ROS与钙离子水平增强了。利用流式细胞术检测化合物6k对NCI-H460细胞的细胞周期影响,结果表明化合物6k将NCI-H460细胞周期阻滞在S期。最后,我们采用Western blot检测经化合物6k处理后,NCI-H460 细胞中 caspase-9,caspase-3,caspase-12,calpain,caspase-4,CHOP,GRP78,p-PERK 以及 p-eIF2α 蛋白水平的表达。结果表明,caspase-9,caspase-3,caspase-12,calpain,caspase-4,CHOP以及GRP78蛋白水平的表达随着药物作用时间的增加而逐渐增加,同时观察到p-PERK以及p-elF2α蛋白磷酸化,这都是细胞凋亡的重要标志。因此,我们可以进一步确认化合物6k是通过诱导癌细胞凋亡从而抑制癌细胞生长。总之,通过引入硫脲和硝基基团到肽骨架中,提高了蛋白酶体抑制剂的活性。因此,我们推断包含硫脲骨架的二肽化合物是具有逆转药物多药耐药性功能的双重蛋白酶体抑制剂。