食管癌是一种由食管黏膜上皮或腺体发生的恶性肿瘤,是常见的消化道恶性肿瘤之一。食管癌有明显的地域差异性,在我国西北及华北地区多见,尤其是河南省林州市食管癌的发病率和死亡率居全国首位,我国食管癌发病率和死亡率也是世界最高。食管鳞状细胞癌是食管癌最多见的组织学类型,其淋巴道转移是食管癌患者病情发展或死亡的重要原因之一基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)属于MMPs家族,可以降解基底膜成分和细胞外基质,进而促进肿瘤细胞的侵袭和转移能力。金属蛋白酶组织抑制剂-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2, TIMP-2)是TIMPs家族成员之一,能够特异性抑制MMP活性和细胞基底膜的降解,进而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。MMPs和TIMPs之间的平衡对于维持细胞外基质的完整状态起重要作用。MMPs与TIMPs之间失衡是造成肿瘤细胞侵袭转移的重要因素之一。研究表明,MMP-9在多种恶性肿瘤中表达增高,MMP-9在肿瘤细胞中的表达高于正常组织。TIMP-2可以抑制所有MMPs,TIMP-2的表达与食管癌淋巴结转移呈负相关,伴有淋巴结转移者TIMP-2低表达或呈阴性。肿瘤淋巴道转移是肿瘤扩散及发展的重要途径,肿瘤相关微淋巴管内皮细胞是肿瘤发生淋巴道转移的重要界面,肿瘤细胞与其微淋巴管内皮细胞间的相互作用是肿瘤细胞淋巴道播散的关键步骤。目前对食管癌细胞与食管癌相关淋巴管内皮细胞之间相互关系的研究尚未见报道,本实验使用不同淋巴管内皮细胞条件培养基培养高分化食管癌EC9706细胞和低分化食管癌KYSE150细胞,采用免疫细胞化学、Western blot法检测各组细胞中MMP-9、TIMP-2蛋白表达水平；采用原位杂交、RT-PCR法检测各组细胞中MMP-9、TIMP-2mRNA表达水平；采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况；采用Transwell法检测各组细胞的侵袭能力。通过构建裸鼠食管癌移植瘤模型,对各组移植瘤及周围组织进行D2-40、LYVE-1免疫组化染色,标记微淋巴管并测定微淋巴管密度(LMVD),探讨不同分化程度的食管癌细胞与食管癌相关淋巴管内皮细胞间的相互影响,为临床阻断食管癌等恶性肿瘤的淋巴道转移奠定重要的理论基础。材料和方法1.人食管鳞癌EC9706细胞由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠；人食管鳞癌KYSE150细胞和人食管癌相关微淋巴管内皮细胞购买于上海拜力生物科技有限公司；幼儿真皮来源的微淋巴管内皮细胞购买于美国Sciencell公司；Balb/c裸鼠购买于上海西普尔必凯实验动物有限公司。2.将食管癌相关微淋巴管内皮细胞和正常人幼儿真皮来源的微淋巴管内皮细胞在同等条件下培养,待第二代细胞融合后,采用无血清培养基培养过夜,收集两组相应的内皮细胞条件培养基。3.采用两组内皮细胞条件培养基分组培养EC9706细胞和KYSE150细胞,同时设空白对照组。培养24h后收集各组细胞。4.细胞培养分组：共分成3大组培养,即实验组、实验对照组和空白对照组。实验组(即E组)分为E1组和E2组。E1组：EC9706细胞换用食管癌相关微淋巴管内皮细胞条件培养基培养；E2组：KYSE150细胞换用食管癌相关微淋巴管内皮细胞条件培养基培养。实验对照组(即C组)分为C1组和C2组。C1组：EC9706细胞换用正常人幼儿真皮来源的微淋巴管内皮细胞条件培养基培养；C2组：KYSE150细胞换用正常人幼儿真皮来源的微淋巴管内皮细胞条件培养基培养。空白对照组(即K组)分为K1组和K2组。K1组：EC9706细胞继续使用原培养基培养；K2组：KYSE150细胞继续使用原培养基培养。5.采用免疫细胞化学、Western blot法检测各组细胞中MMP-9、TIMP-2蛋白表达；采用原位杂交、RT-PCR法检测各组细胞中MMP-9、TIMP-2mRNA表达。6.CCK-8法检测各组细胞的增殖情况。7.Transwell法检测各组细胞的侵袭力。8.构建裸鼠食管癌移植瘤模型,裸鼠分组按照上述培养食管癌细胞的分组。裸鼠接种肿瘤细胞5周后处死并取瘤,计算各组瘤体体积。9.对各组移植瘤及周围组织进行D2-40、LYVE-1免疫组化染色,标记微淋巴管并测定LMVD。10.统计学处理：使用SPSS17.0统计软件进行数据分析,检验标准α=0.05。结果1.免疫细胞化学检测MMP-9、TIMP-2蛋白表达：MMP-9蛋白在实验组中的表达量高于实验对照组,且显著高于空白对照组,两者比较,差异均具有统计学意义(P均<0.05)；MMP-9蛋白在实验对照组中的表达量高于空白对照组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；MMP-9蛋白在实验组中E2组的表达量高于E1组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。TIMP-2蛋白在实验组中的表达量低于实验对照组,且显著低于空白对照组,两者比较,差异均具有统计学意义(P均<0.05)；TIMP-2蛋白在实验对照组中的表达量低于空白对照组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；TIMP-2蛋白在实验组中E2组的表达量低于E1组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.原位杂交法检测MMP-9、TIMP-2mRNA表达：MMP-9mRNA在实验组中的表达量高于实验对照组,并显著高于空白对照组,两者比较,差异均具有统计学意义(P均<0.05)；MMP-9mRNA在实验对照组中的表达量高于空白对照组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；MMP-9mRNA在实验组中E2组的表达量高于E1组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。TIMP-2mRNA在实验组中的表达量低于实验对照组,且显著低于空白对照组,两者比较,差异均具有统计学意义(P均<0.05)；TIMP-2mRNA在实验对照组中的表达量低于空白对照组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；TIMP-2mRNA在实验组中E2组的表达量低于E1组,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。3. RT-PCR法检测MMP-9、TIMP-2mRNA表达：MMP-9mRNA在实验组中的表达量高于实验对照组,并显著高于空白对照组,两者比较,差异均具有统计学意义(P均<0.05)；MMP-9mRNA在实验对照组中的表达量高于空白对照组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；MMP-9mRNA在实验组中E2组的表达量高于E1组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。TIMP-2mRNA在实验组中的表达量低于实验对照组,且显著低于空白对照组,两者比较,差异均具有统计学意义(P均<0.05)；TIMP-2mRNA在实验对照组中的表达量低于空白对照组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；TIMP-2mRNA在实验组中E2组的表达量低于E1组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.Western blot法检测MMP-9、TIMP-2蛋白表达：MMP-9蛋白在实验组中的表达量高于实验对照组,且显著高于空白对照组,两者比较,差异均具有统计学意义(P均<0.05)；MMP-9蛋白在实验对照组中的表达量高于空白对照组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；MMP-9蛋白在实验组中E2组的表达量高于E1组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。TIMP-2蛋白在实验组中的表达量低于实验对照组,且显著低于空白对照组,两者比较,差异均具有统计学意义(P均0.05)；TIMP-2蛋白在实验对照组中的表达量低于空白对照组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；TIMP-2蛋白在实验组中E2组的表达量低于E1组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.CCK-8法检测各组细胞的增殖情况：实验组细胞的增殖能力最强,其中E2组细胞的增殖能力高于E1组,且E2组细胞在所有分组的细胞中增殖能力最强；实验组细胞的增殖能力高于实验对照组,且显著高于空白对照组,两者比较,差异均具有统计学意义(P均<0.05)；实验对照组细胞的增殖能力高于空白对照组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。6.Transwell法检测各组细胞的侵袭力：实验组细胞的穿膜细胞数最多,其中E2组细胞的穿膜细胞数多于E1组,且E2组细胞在所有分组的细胞中穿过基底膜的细胞数最多,细胞侵袭能力最强；实验组细胞穿过基底膜的细胞数高于实验对照组,且显著高于空白对照组,两者比较,差异均具有统计学意义(P均<0.05)；实验对照组细胞的穿膜细胞数高于空白对照组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。7.裸鼠接种食管癌细胞后皮下移植瘤明显,成瘤后每2-3天测量各组裸鼠成瘤体积,成瘤5周后处死裸鼠,测量各组瘤体体积分别为：2542.21±.12.65、2872.42±13.12、2264.51±13.95、2334.27±14.03、1437.56±17.37和1643.31±14.09,实验组裸鼠成瘤体积最大,其中E2组裸鼠移植瘤体积大于E1组,且E2组移植瘤体积在所有分组的移植瘤中体积最大,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；实验组(E组)裸鼠移植瘤体积大于实验对照组(C组),且显著大于空白对照组(K组),两者比较,差异均具有统计学意义(P均<0.05)；实验对照组与空白对照组两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。8.D2-40、LYVE-1标记微淋巴管并测定LMVD:实验组的两组食管癌移植瘤体及周围组织中D2-40、LYVE-1标记的LMVD高于实验对照组,且显著高于空白对照组,两者比较,差异均具有统计学意义(P均<0.05)；其中E2组D2-40、LYVE-1标记的LMVD最高,且E2组高于E1组,两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；实验对照组中D2-40、LYVE-1标记的LMVD高于空白对照组,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.食管鳞癌相关微淋巴管内皮细胞可体外促进食管鳞癌细胞的增殖及侵袭能力。2.食管鳞癌相关微淋巴管内皮细胞对不同分化程度的食管鳞癌细胞影响不同,对低分化食管鳞癌细胞影响更为明显；此作用可能与上调食管癌细胞的MMP-9表达,下调TIMP-2表达有关。3.食管鳞癌相关微淋巴管内皮细胞可促进裸鼠食管癌移植瘤的生长及淋巴管生成。