宿主蛋白NPM1 SUMO化修饰在PCV2复制过程中作用及机制研究

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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是危害养猪业的重要病原,PCV2引起机体疾病的严重程度与其在体内的复制水平密切相关。目前研究发现,PCV2 Cap在病毒复制过程中是不可或缺的,其作用机制是通过与多种宿主蛋白互作进而调控病毒复制。前期研究发现,在PCV2感染的野生型PK-15细胞中,与Cap互作的核仁磷酸蛋白1(Nucleophosmin 1,NPM1)的表达水平并未随着病毒的复制发生明显变化,但敲除PK-15细胞中npm1基因后,病毒的复制水平显著降低。有研究报道,NPM1通常通过自身的不同翻译后修饰调控来发挥其相应功能。因此推测,在PCV2感染的PK-15细胞中,NPM1可能通过其翻译后修饰调控PCV2复制,然而,NPM1是通过何种翻译后修饰调控PCV2复制及其具体机制迄今尚不清楚。本研究拟首先确定PCV2感染PK-15细胞中NPM1的翻译后修饰方式以及具体翻译后修饰的位点,然后,探究PCV2诱导NPM1发生翻译后修饰的具体分子机制,最后,明确NPM1翻译后修饰对PCV2复制的影响。研究结果将为进一步揭示PCV2复制机制提供理论依据。研究取得以下结果:1.PCV2感染促进宿主蛋白pNPM1发生SUMO化修饰研究发现,与MOCK组相比,PCV2感染组NPM1(38 k Da)的表达水平未发生明显变化(P>0.05),但检测到一条高于250 k Da的蛋白条带,在感染6 h~18 h极显著上升(P<0.01),在感染24 h下降至MOCK组相同水平(P>0.05)。利用si RNA干扰PK-15细胞中npm1基因发现,与转染对照(si-NC)组相比,si RNA#1和si RNA#2组中NPM1(38 k Da)水平和NPM1(高于250 k Da)的水平均极显著降低(P<0.01)。在npm1基因敲除的PK-15(PK-15npm1-/-)细胞中,无论PCV2感染与否,均未检测到NPM1(38 k Da)和NPM1(高于250 k Da)蛋白条带。比对发现猪源NPM1(pNPM1)包含2个与人源NPM1(h NPM1)相同的能导致被修饰蛋白分子量显著增加的SUMO化修饰位点(K230和K263)。构建pNPM1 SUMO化修饰位点突变载体pNPM1(K230R)、pNPM1(K263R)和pNPM1(K230R&K263R),分别转染PK-15npm1-/-细胞,PCV2感染后,western blotting检测结果显示,与野生型pNPM1组相比,pNPM1(K230R)组细胞中pNPM1(高于250 k Da)水平降低,但不显著(P>0.05),pNPM1(K263R)组细胞中pNPM1(高于250 k Da)水平极显著降低(P<0.01),pNPM1(K230R&K263R)组细胞中未检测到pNPM1(高于250 k Da)。2.pNPM1 SUMO化修饰是PCV2 Cap激活了ERK/SAE1/Ubc9通路而发生的构建SUMO1、SUMO2和SUMO3真核表达载体,并分别与野生型pNPM1表达载体共转染PK-15npm1-/-细胞,1 MOI PCV2感染细胞12 h。激光共聚焦检测结果显示,在MOCK组中,pNPM1定位于核仁和核质,3种SUMO在胞质和胞核均存在,且与pNPM1共定位于核仁,在PCV2感染组中,pNPM1主要定位于核仁,3种SUMO也存在于胞质与胞核,且与pNPM1共定位于核仁。Co-IP结果显示,与MOCK组相比,PCV2感染促进了pNPM1与SUMO2和SUMO3的互作(P<0.01)。western blotting检测结果显示,随着PCV2感染时间延长,与MOCK组相比,SAE1表达水平未发生明显变化(P>0.05),而Ubc9的表达水平在PCV2感染6 h~18 h极显著上升(P<0.01),24 h下降至MOCK组相同水平(P>0.05)。分别用表达PCV2 Rep(r Ad-Rep)、Cap(r Ad-Cap)和ORF3(r Ad-ORF3)的重组腺病毒及空白重组腺病毒(r Ad-blank)感染PK-15细胞,western blotting检测结果显示,与r Ad-blank组相比,只有r Ad-Cap组SUMO化pNPM1水平极显著上升(P<0.01)。不同信号通路抑制剂处理PK-15细胞,PCV2感染12 h,western blotting检测结果显示,相较于DMSO组,ERK信号通路抑制剂组中SUMO化pNPM1表达水平极显著下降(P<0.01),而其他组无明显变化(P>0.05),同时Ubc9的表达水平也极显著降低(P<0.01)。3.pNPM1 SUMO化修饰促进PCV2复制将野生型和不同SUMO化修饰位点突变pNPM1载体分别与GFP-Cap表达载体共转染PK-15npm1-/-细胞,激光共聚焦检测结果显示,野生型pNPM1和pNPM1(K230R)与Cap共定位于核仁,仅存在少量pNPM1(K263R)与Cap共定位于核仁,而pNPM1(K230R&K263R)不与Cap发生共定位。Co-IP结果显示,与野生型pNPM1组相比,pNPM1(K230R)与Cap的互作变化不明显(P>0.05),pNPM1(K263R)与Cap的互作极显著减少(P<0.01),而pNPM1(K230R&K263R)与Cap不发生互作。将野生型和不同SUMO化修饰位点突变pNPM1载体分别转染PK-15npm1-/-细胞,1 MOI PCV2感染12 h,测定PCV2 TCID50和DNA拷贝数。结果显示,与野生型pNPM1相比,pNPM1(K230R)对PCV2复制的影响不明显(P>0.05),而pNPM1(K263R)和pNPM1(K230R&K263R)突变体均极显著抑制PCV2的复制(P<0.01)。原位杂交试验结果显示,与野生型pNPM1组相比,pNPM1(K230R)组PCV2 DNA模板链和复制链变化不明显(P>0.05),而pNPM1(K263R)和pNPM1(K230R&63R)组中PCV2 DNA模板链和复制链极显著减少(P<0.01)。本研究发现PCV2感染PK-15细胞能够促进pNPM1发生SUMO化修饰,这种修饰是PCV2 Cap激活了ERK/SAE1/Ubc9通路而发生的,进一步研究发现pNPM1SUMO化修饰促进其与PCV2 Cap的互作,进而促进PCV2复制。研究结果为进一步阐明PCV2复制机制奠定了基础。
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