背景和目的胰腺癌是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，具有极强的侵袭和转移能力，加之其发病部位的特殊性及症状的隐匿性，绝大多数患者出现症状时已发生局部浸润或远处转移，从而丧失手术机会，且其对化、放疗均不敏感，五年生存率不足5%。因此，对胰腺癌浸润和转移机制的深入探索有助于寻找治疗胰腺癌的分子靶点，具有重要的基础和临床价值。本课题组前期研究发现，人类真核翻译延长因子1A2（EEF1A2）在胰腺癌组织中表达异常增高，且EEF1A2过表达能够显著促进胰腺癌细胞的增殖和迁移能力，由此推测EEF1A2可能在胰腺癌侵袭转移中发挥重要作用。因此，本研究通过分析EEF1A2在人类胰腺癌组织中的表达情况及其与临床转移和预后的关系，并经体内和体外试验进一步明确EEF1A2在胰腺癌侵袭转移中的作用。此外，本研究还利用基因芯片技术分析EEF1A2过表达对胰腺癌细胞中转移相关基因及相关细胞信号通路的影响，试图阐明EEF1A2促进胰腺癌侵袭转移的可能分子机制。方法1、应用组织芯片及免疫组化技术检测EEF1A2蛋白在胰腺癌组织中的表达，分析其表达与患者临床病理特征及预后的关系。同时以Real time-PCR及Western Blot方法及Matrigel侵袭实验检测胰腺癌细胞株SW1990、BxPC-3、Panc-1及Capan-1中EEF1A2mRNA和蛋白表达以及体外侵袭能力，分析EEF1A2表达水平与胰腺癌细胞体外侵袭能力的相关性。2、将携带EEF1A2全长基因的慢病毒和空病毒分别侵染SW1990细胞并经嘌呤霉素筛选出稳定过表达EEF1A2的细胞株SW1990-EEF1A2和对照细胞SW1990-GFP；用特异性靶向EEF1A2的siRNA转染Panc-1细胞。应用Real time-PCR及Western Blot方法检测上述处理后细胞中EEF1A2的表达变化情况，同时应用划痕实验、侵袭实验观察侵（转）染前后细胞生物学行为的改变。3、建立裸鼠尾静脉注射肺转移模型及腹腔转移模型，将7周龄裸鼠随机分为两组，鼠尾和腹腔内分别注射SW1990-EEF1A2和SW1990-GFP细胞（1×106/只），指定时间处死裸鼠，观察统计各组肺转移和腹腔转移情况。4、应用基因芯片技术检测SW1990-EEF1A2和对照细胞中表达差异的转移相关基因，继以Real time-PCR方法对上述差异基因的表达进行验证。Western Blot和明胶酶谱法分别检测上调和敲低EEF1A2表达对胰腺癌细胞中MMP-9蛋白表达及上清液MMP-9活性的影响，并用侵袭及迁移实验检测MMP-9特异性抑制剂MMP-9Inhibitor I对SW1990-EEF1A2和对照细胞的侵袭及迁移能力的影响。免疫组化法检测胰腺癌组织中EEF1A2和MMP-9的表达情况，并分析两者的表达相关性。5、Wesern blot方法检测过表达EEF1A2对胰腺癌细胞PI3K/AKT信号通路的影响，继以检测AKT通路特异性抑制剂LY294002对SW1990-EEF1A2和对照细胞的侵袭、迁移能力的影响以及对MMP-9蛋白表达及活性的影响。结果1、EEF1A2在胰腺癌组织中普遍表达，阳性表达率为77.8%（76/97），而在正常胰腺及慢性胰腺炎组织中表达阴性。EEF1A2阳性表达与胰腺癌淋巴结转移（P=0.039）、神经浸润（P=0.043）和TNM分期（P=0.040）显著相关，而与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小以及肿瘤分化程度无显著相关性。Kaplan-Meier生存分析显示，EEF1A2阳性表达的胰腺癌患者中位生存期（11.7个月）明显短于EEF1A2阴性患者（17.5个月，P<0.001）。Cox多因素生存分析显示EEF1A2阳性表达是胰腺癌患者预后不良的相对独立危险因素。EEF1A2在胰腺癌细胞SW1990、BxPC-3、Panc-1及Capan-1中呈不同程度表达，且其表达水平与细胞体外侵袭能力呈现正相关性。2、成功筛选出稳定过表达EEF1A2的人胰腺癌细胞株SW1990-EEF1A2和对照细胞SW1990-GFP。Real time-PCR和Western Blot结果显示EEF1A2mRNA和蛋白质在SW1990-EEF1A2细胞中表达较对照细胞SW1990-GFP明显增高（P<0.05）。特异性的EEF1A2-siRNA转染Panc-1细胞48h后，EEF1A2的mRNA和蛋白质表达明显低于对照组细胞（P<0.05）。Transwell侵袭实验结果显示SW1990-EEF1A2细胞24h的穿膜细胞数（60.13±4.31）明显高于对照组细胞（33.43±3.57；P<0.05）；体外划痕实验显示，EEF1A2过表达可显著提高细胞的运动能力（P＜0.05）。与此相反，siRNA敲低EEF1A2表达可明显减弱Panc-1细胞的体外侵袭、迁移能力（P<0.05）。3、鼠尾静脉注射肺转移实验显示SW1990-EEF1A2组裸鼠的肺转移率（100%，5/5）显著高于对照组（20%，1/5；P<0.05）。腹腔转移实验显示，SW1990-EEF1A2组裸鼠的腹腔内转移灶数目（16.5±6.11个）明显多于对照组（6.25±2.2个，P<0.05）。4、基因芯片结果显示，过表达EEF1A2可导致SW1990细胞中10个转移相关基因发生变化（>1.5倍），其中，MMP-9变化最大，为上调2.54倍。Real time-PCR和Western Blot结果进一步证实SW1990-EEF1A2细胞中MMP-9的表达较对照细胞显著升高（P<0.05）。明胶酶谱试验显示SW1990-EEF1A2细胞上清液中MMP-9的活性亦显著高于对照细胞（P<0.05）；与此相反，siRNA敲低EEF1A2表达则可明显降低Panc-1细胞中MMP-9的蛋白表达和上清液中MMP-9的活性（P<0.05）。MMP-9特异性抑制剂可显著抑制SW1990-EEF1A2和SW1990-GFP细胞的体外迁移和侵袭能力（P<0.05）。免疫组化结果显示，胰腺癌组织中EEF1A2和MMP-9的蛋白表达呈正相关性（P <0.05）。5、过表达EEF1A2可上调SW1990细胞中PI3K/AKT信号通路的活性（P<0.05）。AKT通路抑制剂LY294002可剂量依赖性地抑制SW1990-EEF1A2细胞AKT的活性和MMP-9的蛋白表达和活性，以及细胞体外迁移和侵袭能力（P <0.05）。结论1、EEF1A2在胰腺癌组织中普遍表达，但不表达于正常胰腺和慢性胰腺炎组织，且其阳性表达与胰腺癌淋巴结转移、神经浸润和TNM分期呈正相关。EEF1A2阳性表达的胰腺癌患者中位生存期明显短于EEF1A2阴性患者。EEF1A2阳性表达是胰腺癌患者预后不良的相对独立危险因素。2、EEF1A2在不同胰腺癌细胞中的表达水平与细胞的体外侵袭能力呈正相关。过表达EEF1A2可增强胰腺癌细胞SW1990的体外侵袭和迁移能力，反之，敲低EEF1A2则显著抑制了胰腺癌Panc-1细胞的体外侵袭和迁移。此外，过表达EEF1A2也能明显促进SW1990细胞在裸鼠体内的转移。3、EEF1A2参与上调胰腺癌细胞MMP-9的表达和分泌活性，并且MMP-9介导了EEF1A2的促侵袭和迁移效应。胰腺癌组织中的EEF1A2与MMP-9表达呈正相关。过表达EEF1A2激活了胰腺癌细胞中PI3K/AKT信号通路，继而上调了MMP-9的表达和分泌活性。