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目的:
本实验通过ELISA法检测CCh患者球结膜成纤维细胞基质金属蛋白酶的表达，并采用杞精明目汤药物血清对成纤维细胞MMPs和TIMPs的调控;将杞精明目汤应用于临床，观察其对CCh临床疗效情况。
方法:
1、结膜松弛症球结膜成纤维细胞的原代培养及细胞鉴定:采用组织块贴壁法原代培养结膜松弛症的球结膜成纤维细胞并进行传代，采用倒置显微镜下细胞形态学观察及细胞免疫荧光和流式细胞术(FCM)对成纤维细胞特异性蛋白表达进行细胞鉴定。
2、成纤维细胞基质金属蛋白酶的表达及药物血清对其调控:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质测定的实验方法，检测CCh成纤维细胞MMPs的表达，并采用不同浓度的杞精明目汤药物血清对其调控。
3、两种CCh诊断和分级标准的对比分析，选择一种更适用于临床实验的标准:采用H(o)h和张兴儒教授的两种标准对同一人群进行调查，并通过两种标准获得患病情况进行分析，比较两种标准的差异。
4、杞精明目汤对CCh临床疗效的观察:采用张兴儒教授的标准，并根据收纳标准和排除标准收集上海中医药大学附属普陀医院眼科门诊的肝肾阴虚型CCh患者，按就诊的先后顺序随机分为杞精明目汤联合人工泪液治疗组和单纯人工泪液对照组，治疗前、治疗三个月后分别进行眼表疾病指数评分(OSDI)、泪膜破裂时间(BUT)、基础Schirmer试验(Sit)、印迹细胞学检查分级(CIC)，对各项指标进行分析。
结果:
1、细胞培养和鉴定:CCh球结膜组织贴壁法进行细胞原代培养，选用含10％胎牛血清和青链霉素、0.1％FGS的DMEM培养液，进行原代培养的成纤维细胞生长状态较好，并能进行传代。成纤维细胞形态学观察显示细胞形态一致，大小均一，呈放射状排列，为长梭形或两头尖的长条状。细胞免疫化学染色，荧光显微镜下可见CCh球结膜成纤维细胞Vimentin表达阳性，Keratin(C11)表达阴性。流式细胞术检测成纤维细胞Vimentin表达阳性，Keratin(C11)表达阳性极低。
2、CCh球结膜成纤维细胞MMPs的表达:实验组MMP-1平均表达(437.62±13.62ng/ml)较对照组高，差异有统计学意义(F=11.13，P=0.01＜0.05);实验组MMP-3平均表达(0.29±0.02ng/ml)较对照组高，差异有统计学意义（F=48.14，P=0.00＜0.01）;实验组TIMP-1平均表达(0.48±0.00ng/ml)与对照组比较，差异无统计学意义（F=0.64，P=0.56＞0.05）;实验组TIMP-3平均表达(0.17±0.01ng/ml)较正常结膜对照组低，差异有统计学意义(F=14.23，P=0.005＜0.01)。
3、不同浓度的药物血清对CCh成纤维细胞MMPs的调控作用:五个不同浓度的药物血清对MMP-1均有抑制作用，其中，5％的药物血清浓度最显著，其次是10％、20％;对MMP-3有抑制作用的为1％浓度的药物血清;五个浓度的药物血清对TIMP-3均有提升作用，其中，20％的药物血清浓度最显著，其次是15％。
4、两种CCh诊断和分级标准对同一人群进行调查的患眼情况的对比分析:抽样调查的246人中，根据H(o)h的标准，193例诊断为CCh，患病率为78.46％;根据Zhang的标准，96例诊断为CCh，患病率为39.02％，H(o)h组的患病率高于Zhang组的患病率，差异有统计学意义(x2=78.91，P＜0.01)。两种标准的患病率均随着年龄增大，CCh患眼的比例逐渐增高。Zhang的标准不仅根据松弛结膜的皱褶，而且考虑到患者的临床症状、BUT等一些辅助诊断分级条件。
5、杞精明目汤对CCh临床疗效的观察:实验组和对照组治疗前一般资料比较，无统计学意义(P＞0.05），具有可比性。实验组和对照组治疗前OSDI评分、BUT(s)、Sit(mm)、CIC分级各项指标比较，无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。OSDI评分结果显示，实验组治疗前(43.07±15.90)与治疗后（26.23±20.08）比较，差异有统计学意义（Z=-3.748，P=0.000＜0.01）;对照组治疗前（40.97±20.84）与治疗后（36.44±21.08）比较，差异无统计学意义（Z=-1.203，P=0.229＞0.05）;BUT结果显示，实验组治疗前（6.87±1.26s）与治疗后(9.45±1.50s)比较，差异有统计学意义(t=-6.855，P=0.000＜0.05);对照组治疗前(7.00±1.22s)与治疗后(8.74±1.26s)比较，差异有统计学意（t=-5.875，P=0.000＜0.05）;两组治疗后组间比较，差异有统计学意义（t=2.041，P=0.046＜0.05);Sit结果显示，实验组治疗前（8.90±2.14mm）与治疗后(9.50±1.93mm)比较，差异无统计学意义（t=-1.076，P=0.287＞0.05），对照组治疗前（8.23±2.05mm）与治疗后(8.67±1.83mm)比较，差异无统计学意义（t=-0.959，P=0.341＞0.05）;CIC分级结果显示，实验组和对照组治疗前后比较，无统计学意义。
结论:
1、CCh球结膜组织贴壁法进行原代培养并传代能够获得状态较好的细胞，经过倒置显微镜对细胞形态学的观察及免疫荧光和流式细胞学对成纤维细胞特异性蛋白的表达情况，鉴定为成纤维细胞。
2、CCh球结膜成纤维细胞基质金属蛋白酶的表达失衡，MMP-1、MMP-3呈高表达，TIMP-3呈低表达。杞精明目汤药物血清对CCh球结膜成纤维细胞MMP-1、MMP-3表达具有抑制作用，对TIMP-3表达具有提升作用。
3、两种CCh诊断和分级标准进行分析比较，Zhang的标准更贴近于临床应用，能为临床试验提供较好的依据。
4、杞精明目汤对CCh临床疗效有显著的作用，改善眼表症状以及对提高患者的泪膜稳定性具有重要作用。