冬笋多糖结构表征及其改善细胞炎症和结肠炎的作用

来源 :南昌大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:LittleCam
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多糖是由糖苷键连接10个以上单糖分子形成的长链聚合物,是一类结构复杂的功能活性大分子物质。天然多糖在食疗方面表现出一定的应用潜力,具有安全高效等优点。溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性特发性炎症性肠病(IBD),在亚洲乃至全球的发病率逐年上升。作为一种复发缓解型病症,UC严重影响患者的生活质量。研究表明多糖具有预防和改善UC的功效。在天然植物中,多糖来源广、种类多。因此,从天然植物中寻找具有抗炎活性的多糖具有重要意义。我国竹笋资源物产丰富,冬笋是来源最广泛的竹笋。冬笋富含膳食纤维(主要成分为多糖),竹笋多糖是否具有缓解UC的功效有待进一步探究。目前国内外关于冬笋多糖的分离纯化、结构解析及抗炎活性的研究还未见有报道。因此,本论文以冬笋多糖为研究对象,先从冬笋中分离纯化出多糖(BSDF-1),并对多糖进行分离纯化和结构表征;然后通过体外研究,建立消化酵解模拟体系,探究冬笋多糖组分在胃肠道消化过程中以及在健康人体粪便菌群中酵解过程中的变化;再利用动物实验,建立葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎模型并结合小鼠粪便菌体外酵解研究,探讨BSDF-1改善结肠炎作用的可能机制。最后利用LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞建立细胞炎症模型,探讨BSDF-1对RAW 264.7巨噬细胞的抗炎作用。主要研究结果如下:(1)从冬笋中分离纯化多糖组分,并对其理化性质和结构特征进行研究。采用水提醇沉法、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析和Sephadex G-100凝胶柱层析两步法,从冬笋中获得BSDF-1多糖组分。该组分总糖含量为90.23%,分子量为80.8 kDa,主要由Glc、Gal和Ara组成,其摩尔百分比分别为63.14%、26.77%和10.09%。扫描电镜结果表明:BSDF-1是片状和丝状结构,表面比较光滑。甲基化和NMR分析结果表明BSDF-1主链是由→4)-β-Galp-(1→4)-β-Glcp-(1→3)-β-Glcp-(1→糖苷键连接,端基是由α-Araf-(1→5)-α-Araf-(1→片段连接在主链上。(2)对BSDF-1在体外消化酵解特性进行研究。在胃消化过程中,BSDF-1分子量从80.8 kDa降低为58.4 kDa,还原糖(CR)含量显著增加(p<0.05)。在整个消化过程中,BSDF-1消化率呈现上升趋势和总糖呈现下降趋势,此外消化液不影响BSDF-1的单糖组成,但会影响单糖的摩尔质量比。之后,利用人体粪便菌对BSDF-1的体外酵解特征进行研究。在酵解48 h后,BSDF-1降解率为40.29%,酵解液的p H值由6.89降至4.57,同时产生的乙酸、丙酸、戊酸和丁酸浓度显著升高(p<0.05)。通过16S r RNA测序结果表明BSDF-1的酵解会增加Firmicutes和Actinobacteria的丰度(p<0.05),降低Bacteroidetes和Fusobacteria的丰度。GC-MS结果表明BSDF-1被人体粪便菌群酵解48 h后,代谢产物中羰基化合物的浓度降低,脂肪酸的浓度显著升高(p<0.05)。上述结果表明冬笋多糖对肠道健康有益处。(3)通过葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导建立结肠炎小鼠模型,研究BSDF-1的抗炎作用及其机制。研究分为6组,正常组、模型组、美沙拉秦组(阳性对照),BSDF-1低剂量组、BSDF-1中剂量组和BSDF-1高剂量组,连续灌胃7天。实验结果表明BSDF-1能显著改善结肠炎小鼠体重减轻、结肠缩短、结肠组织破坏、结肠黏膜损伤和炎症细胞浸润;其中高剂量(400 mg/kg)的BSDF-1可显著降低结肠组织中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-αm RNA的表达水平和MDA、MPO以及NO的浓度,显著增加IL-10、T-SOD和lipocalin-2的浓度(p<0.05);显著抑制结肠炎性信号通路的激活,上调连接蛋白的m RNA表达;肠道菌群的多样性研究表明,高剂量的BSDF-1可显著降低结肠内容物中Parabacteroides、Mucispirillum、Helicobacter、Bacteroides和Streptococcus的丰度水平,显著增加Prevotella、Alistipes、Anaerostipes、Odoribacter、Bifidobacterium、Butyricimonas和Lactobacillus的丰度水平。之后,通过16S r RNA和非靶向代谢组学分析体外酵解中BSDF-1对小鼠结肠炎的影响。正常小鼠粪便添加BSDF-1酵解48 h后,酵解液p H值从6.91下降到5.49,BSDF-1降解率为39.79%,总SCFA含量从8.61±0.38 mmol/L显著增加到26.74±0.90mmol/L。结肠炎模型小鼠添加BSDF-1酵解48 h后,酵解液p H值从7.08下降到6.10,BSDF-1降解率为26.59%,总SCFA含量从5.51±0.79 mmol/L显著增加到16.46±0.71 mmol/L。BSDF-1可通过增加Alistipes、Lactobacillus属的相对丰度,减少Escherichia-Shigella、Enterococcus和Proteus属的相对丰度,从而改善肠道菌群组成。UHPLC-MS/MS结果显示,酵解48 h后,BSDF-1可改变Ornithine、Creatinine、Leucylproline、N-Acetylornithine、N-Acetyl-L-histidine、Creatine等17种代谢产物的含量。结果表明冬笋多糖BSDF-1具有缓解结肠炎症状的作用。(4)探究BSDF-1对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症的缓解效果。实验结果证实BSDF-1显著降低促炎细胞因子的水平,增加抗炎细胞因子的水平,并改变了LPS刺激的RAW 264.7细胞中的巨噬细胞M1和M2标志物的比例;RT-q PCR测定结果显示20μg/mL的BSDF-1可以显著增加炎症因子IL-10、Arg1和CD206的m RNA表达水平,降低IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-23、IL-10、CD86和i NOS的m RNA表达水平。蛋白免疫印迹结果显示20μg/mL的BSDF-1可以显著增加Arg1、AMPK、p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平,显著降低i NOS和p-p65蛋白表达水平。同时,蛋白免疫印迹结果表明AMPKαsi RNA827对沉默AMPK具有较好效果,20μg/mL的BSDF-1处理会激活AMPK,进而影响PI3K/Akt和NF-κB通路。这些结果表明冬笋多糖BSDF-1具有一定的抗炎作用。综上所述,本论文确定了BSDF-1主链是由主链是由→4)-β-Galp-(1→4)-β-Glcp-(1→3)-β-Glcp-(1→糖苷键连接组成,含少量支链的多糖。通过体外模拟消化酵解系统,证实BSDF-1可显著增加脂肪酸的浓度,对肠道健康有有益作用。在此基础上,本论文较为系统地研究了冬笋多糖纯化组分BSDF-1改善细胞炎症和结肠炎的作用。动物实验结果表明,高剂量(400 mg/kg)BSDF-1处理可显著调节肠道菌群、改善肠道屏障功能、减少氧化应激反应。体外细胞实验结果表明BSDF-1具有较好的抗炎活性,可显著增加IL-10、Arg1和CD206的m RNA表达水平和Arg1、AMPK、p-PI3K和p-Akt蛋白的表达水平,与此同时可显著降低IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-23、IL-10、CD86和i NOS的m RNA表达水平和i NOS和p-p65蛋白表达水平。研究结果表明,冬笋多糖BSDF-1有作为抗炎类食品强化剂和食品添加剂的潜力。
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