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研究背景女性盆底功能障碍性疾病(plevic floor disfunction, PFD)是中老年女性的常见病之一,主要症状表现为盆底器官脱垂、压力性尿失禁、性功能异常、慢性盆腔痛或排便困难等,其患病率逐年升高,已成为一个突出的全球性公共卫生问题。不仅严重影响女性的身心健康,同时对社会经济也造成了沉重的负担。盆底支持结构主要包括盆底肌肉及盆底结缔组织,任何能引起盆底支持结构改变的病因均可能导致PFD的发生。国内外研究发现,PFD患者盆底成纤维细胞数目的减少及功能的下降,引起结缔组织中Ⅰ型胶原蛋白(TypeⅠcollagen, CollagenⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白(TypeⅢcollagen, CollagenⅢ)含量降低,盆底支持结构发生改变。干细胞应用于治疗PFD是一个新的思路,利用干细胞替代或修复病变、缺损的盆底组织,重建盆底支持结构和生理功能。脂肪源性干细胞(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)属一类具有增殖和多向分化潜能的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),它具有来源广,取材容易,创伤小,干细胞丰度高,免疫原性低等优点。现干细胞主要应用于压力性尿失禁的治疗,通过尿道旁注入干细胞的方法修复损伤的尿道括约肌,已进入临床实验阶段,但其安全性及长期疗效仍需进一步观察;干细胞在盆底器官脱垂中应用的研究目前较少。结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor, CTGF)是一多肽类生长因子,主要存在于间质组织内,可促进多种细胞增殖、分化,及分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)。国内外研究发现,其可促进成纤维细胞、上皮细胞、骨髓MSCs等不同类型的细胞胶原蛋白表达及分泌增加,但对于外源性CTGF对ADSCs的CollagenⅠ和CollagenⅢ表达的影响,至今无相关研究报道。第一部分大鼠脂肪源性干细胞的分离、培养及鉴定研究目的探讨ADSCs分离、培养、纯化及鉴定的实验方法,观察ADSCs的基本生物学特性、表面抗原特点及其向成骨细胞诱导分化的潜能,为ADSCs的研究提供实验数据。研究方法1.采用Ⅰ型胶原酶消化SD大鼠腹股沟脂肪垫,分离出ADSCs,采用多次传代法对细胞进行纯化。2. MTT法测第1、3、5代细胞生长特性,流式细胞仪检测第3代细胞的细胞周期及表面标记物,同时对第3代细胞中ADSCs进行纯度分析。3.对大鼠ADSCs进行成骨方向诱导,茜红素染色定性鉴定其成骨分化潜能。结果大鼠ADSCs的特点:1.形态特征:原代和传代大鼠ADSCs形态均类成纤维细胞,体外扩增能力好,第13代仍有较好的增殖能力。2.生长曲线:第1、3、5代大鼠ADSCs的生长曲线基本相同,呈“S”形。3.细胞周期分析:第3代大鼠ADSCs中处于G0/G1期的细胞占90.6%,S期细胞3.99%,G2/M期5.41%。4.细胞表面标记物:第3代大鼠ADSCs细胞表面标记物阳性表达率分别为:CD44(99.88%)、CD49d(89.56%)、CD90(99.74%)、CD105(95%)、CD34(3.04%)、CD45(0.26%)、CD106(0.85%)。5.成骨诱导分化:大鼠ADSCs经成骨诱导后形成岛状细胞外沉积,并随诱导时间延长而增多,诱导14天时茜红素染色呈阳性。结论实验所分离细胞经细胞周期、表面标记物检测及成骨分化的实验,证明此细胞为大鼠ADSCs,且第3代ADSCs纯度高,具有向成骨细胞分化的潜能,提示ADSCs有望成为盆底组织工程学理想的种子细胞。`第二部分CTGF对大鼠ADSCs的Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白表达、合成及分泌的影响研究目的体外培养条件下,采用CTGF刺激大鼠ADSCs,探索CTGF对大鼠ADSCs CollagenⅠ和CollagenⅢ表达、合成及分泌的影响,观察CTGF对大鼠ADSCs定向分化能力的影响,为ADSCs及CTGF应用于盆底功能障碍性疾病的治疗提供组织工程学理论依据。研究方法1. CTGF浓度效应实验:分别以空白对照组(CTGF 0ng/ml)及CTGF 1、10、25、50、100ng/ml不同的浓度梯度对大鼠ADSCs进行1、2、3天的体外刺激,采用RT-PCR半定量方法检测ADSCs的CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表达水平,ELISA检测细胞培养上清液中CollagenⅠ和CollagenⅢ含量。2.长时间体外培养下CTGF对大鼠ADSCs的CollagenⅠ和CollagenⅢ表达的影响:以CTGF 100ng/ml持续刺激大鼠ADSCs至7、14、28天,观察长时间体外培养下CTGF对大鼠ADSCs的CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表达的影响。3. CTGF对ADSCs成骨及成脂定向分化能力的影响: (1)对体外培养的大鼠ADSCs进行CTGF刺激,刺激14天后,进行成骨诱导,茜红素染色鉴定CTGF对ADSCs成骨分化能力的影响。并与无CTGF刺激组进行空白对照。(2)对体外培养的大鼠ADSCs进行CTGF刺激,刺激14天后,进行成脂诱导,油红O染色鉴定CTGF刺激对ADSCs成脂分化能力的影响。并与无CTGF刺激组进行空白对照。4.统计分析:采用SPSS 16.0进行数据分析。实验数据均采用均数±标准差(—x±s)表示。P<0.05表示差异有统计学意义。结果1. CTGF浓度效应实验:不同浓度的CTGF组CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表达随时间延长而增加,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);CTGF浓度1,10,25,50,100ng/ml各组对ADSCs的CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表达增加的作用呈浓度时间依赖性(P<0.05)。CTGF浓度10, 50,100ng/ml各组培养上清液中CollagenⅠ及CollagenⅢ含量随时间延长而增加,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。CTGF浓度10ng/ml组和50ng/ml组CollagenⅠ含量低于100ng/ml组(P<0.05);但10ng/ml组上清液中CollagenⅠ含量与50ng/ml组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。CTGF浓度10ng/ml组CollagenⅢ含量低于CTGF浓度50ng/ml组和100ng/ml组(P<0.05);但50ng/ml组上清液中CollagenⅢ含量与100ng/ml组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.长时间体外培养下CTGF对大鼠ADSCs的CollagenⅠ和CollagenⅢ表达的影响:大鼠ADSCs的CollagenⅠmRNA表达7天时为1.069±0.324,14天时为2.162±0.038,28天时为3.360±0.058; CollagenⅢmRNA表达7天时为1.398±0.073,14天时为4.081±0.835,28天时为4.466±0.049。大鼠ADSCs的CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表达均随时间延长而上升(P<0.05)。3. CTGF对大鼠ADSCs成骨及成脂定向分化能力的影响:CTGF刺激后大鼠ADSCs经成骨诱导未能形成细胞外沉积,茜红素染色阴性;另外,经成脂诱导后细胞未见大量脂滴形成,油红O染色阴性。与无CTGF刺激的空白组对照、体外培养14天后大鼠ADSCs经成骨诱导后茜红素染色阳性,成脂诱导后油红O染色阳性。结论1. CTGF刺激下大鼠ADSCs的CollagenⅠ及CollagenⅢmRNA表达水平增高,合成分泌CollagenⅠ及CollagenⅢ增加,说明CTGF有促进ADSCs的CollagenⅠ及CollagenⅢ表达与分泌的作用。2.以CTGF 100ng/ml浓度刺激体外培养的ADSCs,培养28天时, CTGF对大鼠ADSCs的CollagenⅠ及CollagenⅢmRNA表达仍有促进作用,CollagenⅠ及CollagenⅢmRNA表达随时间延长而上升。3.大鼠ADSCs在体外培养14天后仍具有向成骨及成脂分化的潜能,但在CTGF刺激下,大鼠ADSCs向成骨及成脂分化的潜能消失,其机制还需进一步研究。