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玉米矮花叶病是世界范围内普遍发生的一种病毒性病害,对玉米生产危害严重。利用农艺措施和化学药剂的方法均不能有效防治玉米矮花叶病,选育抗病品种才是防治玉米矮花叶病的最根本途径。但是对矮花叶病具有高抗的玉米材料少,为抗病品种的选育造成了很大困难,转基因技术为培育抗病育种带来了新的思路和方法。本研究根据RNA干扰原理,构建了玉米矮花叶病毒基因RNA干扰载体,通过农杆菌介导法将其转化到玉米基因组中,通过后代鉴定,获得了抗玉米矮花叶病、稳定遗传的转基因材料。主要的研究内容如下:1.在NCBI数据库搜索甘蔗花叶病毒SCMV基因组的NIb序列,与玉米基因组的序列进行BLAST比对,通过去除连续配对达到19个碱基以上的序列后,选择的SCMV的特异NIb序列可以避免在RNA干扰SCMV的过程中发生基因沉默。选取甘蔗花叶病毒NIb的一段大小为530bp的保守序列做为干扰序列并进行人工合成,通过中间载体NPPLT,形成含有内含子的反向重复序列结构,然后将其整合到具有Cre/loxP重组系统的表达载体PNCXB中,构建成玉米矮花叶病毒基因RNA干扰表达载体PNCXB-846。2.以玉米Hi Ⅱ、Hi ⅡB、Hi ⅡA、H99的幼胚和幼胚诱导的愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法,对影响遗传转化各种因素的比较研究,优化了高效的玉米遗传转化体系。结果表明:幼胚大小为1.2-1.8mm,菌液浓度为0.3-0.4,侵染时间10 min为幼胚最佳侵染条件;继代3次,预培养6天,菌液浓度为0.5-0.6,AS浓度为150 mg/L是愈伤组织的最佳侵染条件;用幼胚为转化受体时,不仅可以筛选出抗性愈伤明显、假阳性率低、再生出苗能力强、苗期生长势强的个体,而且从愈伤筛选到遗传转化再生出苗的整个过程时间短;用愈伤组织作为转化的受体时,假阳性率高,再生出苗能力差且生长势弱,许多抗性愈伤在分化和生根两个阶段停止生长。因此,农杆菌介导幼胚获得的抗性愈伤和再生植株较多,且操作简单,效率高,但幼胚诱导成的愈伤组织在特定时期生长状态良好,也适合农杆菌侵染。利用优化的遗传转化体系,获得了 4种基因型受体的抗矮花叶病的转基因玉米植株。3.采用适宜浓度PPT表型鉴定、标记基因PCR、目的基因PCR、接种鉴定4种方法,对Hi Ⅱ、Hi ⅡA、Hi ⅡB、H99的4种基因型T1、T2、T3代转基因株系进行检测和鉴定,结果表明,采用适宜质量浓度PPT处理的表型鉴定可以排除部分假阳性植株,对获得的抗性植株再进行目的基因PCR和病毒接种鉴定调查,既减少了工作量,又提高了鉴定的准确性;接种抗病鉴定结果表明,利用RNAi技术获得的转基因植株与非转基因对照相比抗病性得到明显提高,4种转基因材料中T2代有18个(60.00%)株系抗病性超过相应的非转基因植株,T3代23个(76.67%)株系抗病性超过相应的非转基因对照,1个(3.33%)株系抗病性达到抗病对照四一的免疫水平;T1代抗病率为9.78%～15.00%,T2代抗病率为22.32%～29.79%,T3代抗病率为46.34%～55.86%。结果表明,随着世代的增加外源基因逐渐趋向正常的孟德尔遗传;对表现抗性程度好的T1代转基因植株后代T2代、T3代株系进一步接种鉴定,仍然表现高度抗性,由此推测抗矮花叶病的转基因植株所表现的抗性能稳定遗传;Southern杂交结果进一步证实抗玉米矮花叶病RNA干扰基因846已经整合到玉米基因组中。