乌珠穆沁羊肉作为"绿色食品",肉质鲜嫩,不膻不腻,富含多种人体必需氨基酸和矿物质等。乌珠穆沁羊体质坚实、耐寒耐旱、羔羊成活率高、生长发育迅速、背腰宽平、产肉率高、因群体中存在多脊椎个体而被誉为"国家级畜禽资源保护品种"。此羊生存环境人烟稀少,地域辽阔,羊群多以"自然放牧"方式进行粗放管理。然而,生态环境日趋恶劣、草场逐步退化的今天,这种饲养方式势必对草原生态系统和动物机体生长发育具有微妙影响。本文以动物个体发育过程中肌肉发达作为切入点,分别从生肌调节因子(MRFs)基因相对表达量和肌纤维形态学变化着手研究,探讨自然放牧条件下肌肉发育情况;并结合MRFs家族基因全长序列克隆和基因多态性与个体生长性状间的联系,分析乌珠穆沁羊多脊椎个体种质资源,以期为肌肉发达机理提供可靠的基础数据,并为乌珠穆沁羊遗传育种提供背景支持。具体结果如下:1.利用常规PCR技术首次克隆了乌珠穆沁羊生肌调节因子(MRFs)家族的三个成员基因,通过与GenBank数据库里绵羊相应基因序列进行同源比对,提交GenBank 获得 了基因登录号分别是 Myf5(KT899092),Myf6(KT899093)和Myogenin。MRFs家族各成员全长基因序列均由三个外显子和两个内含子构成,虽片段大小不同,但具有较高的序列同源性;各成员相应预测蛋白也享有较高的保守区域,称之为碱性螺旋-环-螺旋(Basci helix-loop-helix,bHLH)结构域。将乌珠穆沁羊MRFs家族成员与NCBI中绵羊相应序列比对发现:所测样本中Myf5基因全长序列不含任何点突变位点;Myf6全长序列具有两个突变位点分别位于g.1150 C>A和g.1197C>T,均属于沉默突变位点;Myogenin全长序列范围内可能存在十个突变位点均为沉默突变位点,其中八个位点与NCBI中山羊相应序列相同,剩余两个突变位点是乌珠穆沁羊所特有。2.以不同生长性状的乌珠穆沁羊(成年母羊)为受试动物,采用直接测序法分析并获得了 MRFs家族中Myf5、Myf6、Myogenin基因全长序列范围内基因多态性位点。结果显示,所测样本中Myf5基因无SNPs特性;Myf6基因存在一个多态位点,位于g.242 AC>CC>CT,动物个体体重和体高等指标在不同基因型间有显著差异;Myogenin基因存在四个多态位点,分别位于内含子二区域内g.212C>A、g.401 G>A、g.536 C>G、g.556 C>T,且动物体尺指标在同一位点的不同基因型间均无显著差异。由此推测,Myf6基因可用于衡量乌珠穆沁羊生长指标的候选基因或分子标记。3.以不同生长阶段的乌珠穆沁羊作为研究材料,运用荧光定量PCR技术获得了MRFs家族中三个成员基因的不同时空表达模式。结果显示,动物出生后MRFs家族三大基因持相对稳定的表达水平,各月龄间并无显著减少或增加(P>0.05)。由此推测,自然放牧状态下受试动物的正常生长过程对MRFs家族成员基因表达量可能无不良刺激。换言之,不同运动模式、运动强度、季节气候变化(牧草和温度)和正常生长过程等等对肌肉组织中MRFs家族基因表达量可能并无显著的应激反应亦或部位特异性。4.以自由采食的乌珠穆沁羊作为研究对象,观察了不同月龄受试动物不同部位肌肉组织中肌纤维直径及其类型百分比变化规律。结果显示,随着受试动物年龄增长,肌肉组织(背最长肌和股二头肌)中肌纤维直径呈逐步增加的趋势并在9月龄时达到了最高值,而12月龄时该值反而略显减少,成年后(18月龄)纤维直径仍保持相对稳定;肱三头肌中,肌纤维直径增粗一直持续到了 18月龄。推测,肌纤维直径增粗可能具有某程度的解剖学部位特异性。由肌纤维类型百分比变化得知,背最长肌中各肌纤维类型(Ⅰ,Ⅱa和Ⅱb)百分比变化并不明显;股二头肌中Ⅰ型纤维比重较高,同时伴有6.19倍Ⅱa型肌纤维百分比的下降;肱三头肌中Ⅰ和Ⅱa型比重呈持续变化状态直至18月龄。综上所述,自然放牧状态下乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维直径增粗和肌纤维类型百分比变化可能具有某种特定关联关系。5.通过MRFs家族基因表达量、肌纤维直径增粗和纤维类型百分比变化等三者之间相关性检验发现:背最长肌中Myf5基因表达与Ⅰ型肌纤维(r=-0.87,P<0.05)、肌纤维类型比Ⅰ/Ⅱb呈显著负相关关系(r=-0.86,P<0.05),同Ⅱa型肌纤维(r=0.81,P<0.05)、肌纤维类型比 Ⅱa/Ⅱb(r=0.81,P<0.05)和 Ⅱa/Ⅰ(r=0.89,P<0.05)均呈显著正相关关系;同时,肌纤维直径与Ⅰ型肌纤维(r=0.70,P>0.05)、肌纤维类型比Ⅰ/Ⅱb(r=0.68,P>0.05)、Myf5(r=-0.64,P>0.05)基因表达均具有较高的相关关系。股二头肌中MyoG基因表达与肌纤维类型比Ⅰ/Ⅱb显著正相关关系(r=0.81,P<0.05),同Ⅱb型肌纤维也具有较高的负相关关系(r=-0.80,P>0.05);同时,肌纤维直径与MyoG基因表达具有较高负相关关系(r-0.79,P>0.05)。肱三头肌中,肌纤维直径与Ⅰ型肌纤维(r=-0.93,P<0.01)、肌纤维类型比Ⅰ/Ⅱb(r=-0.88,P<0.05)呈显著负相关关系,同Ⅱa型肌纤维(r=0.90,P<0.05)、肌纤维类型比Ⅱa/Ⅰ(r=0.92,P<0.01)呈显著正相关关系;同时,与肌纤维类型比Ⅱa/Ⅱb(r=0.72,P>0.05)和MyoG(r=-0.78,P>0.05)具有较高的相关关系。由此推测,动物生长过程中肌肉发达与上述三种指标之间可能具有密切联系,且伴有部位特异性。综上所述,自然放牧条件下乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维直径基本在9月龄时可达到最高值,该值在其成年及以后呈相对稳定水平;而肌纤维类型变化可能存在Ⅰ>Ⅱa>Ⅱb和/或Ⅱb>Ⅱa>Ⅰ两种逐级转换模式,该模式的激活/抑制可能受到动物年龄(幼龄、青年、成年),自然环境(温度、季节、气候、草场等等),自由采食行为(动物个体采食喜好、季节、采食环境区域植被结构)等等多种潜在因素的综合调控;至今GenBank数据库中反刍动物MRFs家族基因全长序列报道较少,在此弥补了这一空缺并与生长性状指标相结合,推测Myf6基因为可供有效候选基因;同时,在所测样本中MRFs家族mRNA水平在其出生后并无显著变化。