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研究背景乳腺癌(breast cancer,BC)是女性最常见的恶性肿瘤,发病率在全球位居前三。根据2018年的全球癌症数据可知,全球新发癌症人数有1810万,死亡人数有960万,而乳腺癌的发病率与肺癌并列第一,占总人数的11.6%(210万),乳腺癌的死亡率位于第四位,次于肺癌、肝癌、胃癌,占总人数的6.6%(63万)。癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库是一个公共资助的项目,其创建了一个全面的癌症基因组图谱,现已包含有30多个人类肿瘤大群。TCGA可应用于高通量基因组分析,通过肿瘤与非肿瘤组织差异基因的表达分析,可发现新的与肿瘤相关的生物标志物,用于肿瘤的诊断、预后判断和作为新的治疗靶点。B4GALNT2是由血管内皮细胞产生的且与血型相关的抗原,相关研究表明B4GALNT2是异种移植新发现的抗原、可改变沙门氏菌的易感性、影响肠道菌群的分布,但该基因与肿瘤恶性程度的相关性尚无相关研究。故本研究的目的主要探索B4GALNT2基因与乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的相关性及其相关机制。目的探索B4GALN T2基因与乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的相关性及其相关机制。方法1.通过TCGA数据库下载包含RNAseq的乳腺癌患者的相关数据,并进行乳腺癌组织与非肿瘤组织间RNAseq的对比分析,确定B4GALNT2基因在乳腺癌组织与非肿瘤组织之间的差异表达情况。2.采用实时荧光定量PCR(real time PCR,rt-PCR)技术检测B4GALNT2在5种乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、HCC1937、T47D、MCF7、SK-BR-3)中的表达水平,确定细胞模型。3.根据B4GALNT2基因的序列信息构建sh-B4GALNT2慢病毒载体,包装sh-B4GALNT2慢病毒,转染MDA-MB-231、HCC1937两种细胞株。在对照及目的慢病毒感染目的细胞72小时后于荧光显微镜下观察细胞转染效率,用rt-PCR验证B4GALNT2基因的敲低效率,敲减效率达50%以上时进行后续的细胞功能实验和动物实验。Western Blot检测B4GALNT2基因敲低后该蛋白的表达水平。通过Celigo细胞计数实验、MTT增殖实验、细胞凋亡实验、细胞迁移实验、细胞侵袭实验和细胞周期实验检测敲低B4GALNT2后对体外的乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。4.把敲低B4GALNT2基因后的MDA-MB-231细胞及对照组细胞分别注射到裸鼠皮下构建小鼠成瘤模型,比较实验组与对照组小鼠的肿瘤体积及肿瘤重量差异,判断B4GALNT2基因对体内乳腺癌细胞增殖的影响。5.对乳腺癌患者的B4GALNT2基因进行基因富集分析,使用GSEA的算法探索与B4GALNT2基因可能的相关通路。结果1.通过TCGA数据库共获取1094例包含RNAseq的乳腺癌患者的数据,其中有成对组织(癌与癌旁)的患者有106例。通过乳腺癌组织与非肿瘤组织间基因的差异表达分析,发现B4GALNT2在癌组织中明显高表达(p<0.05)。2.通过RT-PCR实验检测5种乳腺癌细胞系B4GALNT2的表达情况,结果是:MDA-MB-231、HCC1937两种细胞系的表达量最少,T47D、MCF7两细胞系表达量最多,SK-BR-3表达量居中,故确定MDA-MB-231、HCC1937作为细胞模型。3.两细胞系的转染效率达90%以上,RT-PCR检测到该基因敲低后的表达量明显降低,敲低效率达50%以上。两细胞系敲低B4GALNT2基因后,Western Blot检测到该蛋白的表达量明显减少;通过Celigo细胞计数及MTT增殖实验、迁移及侵袭实验、细胞凋亡实验,发现实验组细胞的增殖、迁移及侵袭能力减弱和凋亡能力增强;通过细胞周期实验发现两细胞系均存在细胞周期阻滞(p<0.05)。4.裸鼠成瘤实验发现:实验组相对于对照组,小鼠肿瘤体积减小、重量减轻。5.通过对B4GALNT2进行基因富集分析发现,该基因可能参与调控的通路有负调控 TORC1 信号通路、POSITIVE-REGULATION-OF-SYNAPSE-ASSEMBLY信号通路和RESPIRATORY-SYSTEM-PROCESS信号通路,且均呈负相关。结论1.相对于癌旁组织而言,B4GALNT2基因在乳腺癌癌组织中高表达。2.B4GALNT2基因与乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力呈正相关。3.B4GALNT2可能主要是通过激活TORC1等信号通路促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。