基于荧光蛋白/纳米材料的阵列传感新方法

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阵列传感器是受动物嗅觉系统启发开发的新型传感方法,它由一系列传感单元组成,是一种基于对分析物的交互响应所得特征指纹进行分析的方法。由于该方法相对传统检测方法表现出诸多优势,例如快速、简单、对检测样本破坏小等,因此在环境监测、安全筛查、食品检验和生物传感等领域均有广泛应用。环境中各种重金属离子污染危害人体健康,恶化生存环境,急需简单、快速、灵敏、低成本的检测方法。基于此,我们开发了一种三色荧光蛋白阵列传感器用于金属离子的区分。此外,我们还构建了一种基于荧光蛋白(FPs)和红细胞膜修饰的碳化钛(RBC-Ti3C2)的RBC-Ti3C2/FPs荧光阵列传感器用于癌细胞区分。本文的研究内容如下:(1)克隆及表达两端带His-tag的三种荧光蛋白。通过分子克隆构建pET28a-h-mtagbfp-h、pET28a-h-sfcherry-h两种质粒,并利用它们与实验室之前构建的pET28a-h-egfp-h质粒,表达纯化了H-mTagBFP-H、H-EGFP-H、H-sfCherry-H三种荧光蛋白。蛋白两端带His-tag更利于增强金属离子与蛋白之间相互作用,为之后设计阵列传感器用于金属离子的区分和癌细胞的区分奠定基础。(2)基于三色荧光蛋白的阵列传感器用于金属离子的区分。H-mTagBFP-H、H-EGFP-H、H-sfCherry-H的吸收与发射光谱之间具有较好重叠。不同金属离子与蛋白上氨基酸残基配位能力不同,且带负电的蛋白与金属离子之间存在静电相互作用,从而导致蛋白间距有差异,进而产生不同程度的荧光共振能量转移(F?rster resonance energy transfer,FRET)。此外,一些金属离子(如Cu2+)和蛋白相互作用时会发生电子转移使得荧光猝灭。这些多重作用机制导致三种荧光蛋白对于不同的金属离子产生不同的荧光信号变化,再通过线性判别分析(LDA)可实现对多种金属离子的区分,且能在实际水样中进行分析检测。(3)基于FPs和RBC-Ti3C2构建的RBC-Ti3C2/FPs荧光阵列传感器用于癌细胞的区分。将Ti3C2用RBC进行修饰,再与四色荧光蛋白(H-mTagBFP-H、ScGFP、H-sfCherry-H、IRFP)结合构建了RBC-Ti3C2/FPs荧光阵列传感器。Ti3C2能使四种荧光蛋白发生不同程度的荧光猝灭。加入癌细胞后,由于癌细胞膜与RBC之间的结合作用,使与RBC表面结合的部分荧光蛋白被竞争下来,实现一定程度的荧光恢复。不同癌细胞与RBC之间结合作用程度有所不同,进而与四种荧光蛋白的竞争程度也不同,便能使得四种荧光蛋白的荧光强度发生不同程度的变化而荧光响应信号有所差异。通过主成分分析(PCA)实现了对4种不同癌细胞(MCF-7、A549、HepG2、MDA-MB-231)和正常细胞(LO2)之间的区分。
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