果胶杆菌属(Pectobacterium)细菌是十大植物病原细菌之一,主要引起植物的黑胫病和软腐病。果胶杆菌向胞外分泌一系列植物细胞壁降解酶类(PCWDEs),如果胶酶、纤维素酶等,是其主要的致病因子。果胶杆菌寄主范围广泛,亚种多样性丰富,然而目前生产上仍缺乏有效的防治措施,选育抗病品种和提高栽培技术可适当减少黑胫病和软腐病造成的损失。随着马铃薯主粮化的推进,马铃薯在中国的生产面积在不断扩大,马铃薯软腐病和黑胫病将会成为制约该产业发展的重要病害。因此,研究果胶杆菌的致病机制,从而为有效防控马铃薯该类病害提供科学依据,具有深远的意义。本实验室前期研究P.carotovorum subsp.carotovorum菌株PccS 1与寄主黄花马蹄莲互作时,鉴定了 53个受寄主诱导的差异表达蛋白。本文通过实时荧光定量PCR对其中11个蛋白的编码基因进行了转录水平的分析,其中共10个基因在活体互作时的差异表达情况与蛋白水平的一致,验证了蛋白差异表达结果。为了进一步筛选与致病性有关的蛋白,对活体互作时在转录和翻译水平均显著上调表达的两个蛋白:调控Pectobacterium和Dickeya中胞外果胶酶的合成的KdgR和腐胺ABC转运蛋白复合体PotFGHI的重要组成蛋白PotF进行了进一步分析。利用同源重组的方法分别构建了kdgR和potFGHI的敲除突变体,并分析了突变体的生物学表型。kdgR和potFGHI缺失后,△kdgR果胶酶活性比野生型略强,△kdgR和△potFGHI突变体均对PccS1在马蹄莲和白菜上的毒力没有显著的影响。结果表明,KdgR和PotFGHI并不是PccS1致病过程中必需的蛋白。前期研究发现在PccS1与寄主活体互作过程中,6-磷酸葡萄糖脱氢酶Zwf在离体互作和活体互作时均上调表达,而其敲除突变体对致病性没有影响,插入突变体致病性却显著减弱。基因转录分析表明,位于zwf基因下游的eda与之共转录,是zwf插入突变体致病性显著减弱的主要原因。eda编码的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(KDPG)醛缩酶(Eda)是Entner-Doudoroff(ED)途径的关键酶。ED途径是细菌中重要的糖类代谢途径之一,主要代谢底物是葡萄糖酸,对Escherichia coli、Vibrio cholerae、Shigella fexneri等动物病原细菌的定殖、毒性等方面有着重要影响。为了进一步阐明ED途径与果胶杆菌致病性之间的关系,本研究对Pectobacterium中ED途径从生物学功能和进化两方面进行了分析。基因组序列分析发现,PccS1并不具有完整的ED途径(缺少6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(Edd)),而其同属近缘种P.atrosepticum含有完整的ED途径。为了研究ED途径在Pectobacterium致病过程中的功能,本文用同源重组的方法构建了P.atrosepticum(Pba)菌株SCRI 103 9的ED途径突变体Pba-Aeda和Pba-△edd。致病性测定结果表明,Pba-△eda在寄主马铃薯块茎上致病性减弱50%,而△edd对致病性无影响;在常规培养基(LB和MM + 0.2%葡萄糖)中,缺失ecda仅影响Pba最初的生长;胞外酶测定结果显示,Pba-Aeda的胞外果胶酶活性仅为野生型的50%,且不能利用果胶分解产物半乳糖醛酸和多聚半乳糖醛酸作为碳源进行正常生长,外源质粒表达eda可以恢复减弱的表型,而Pba-△edd对Pba的生长和胞外酶活性均无影响。为了进一步探究eda如何影响致病性,对Pba-△eda中编码与果胶代谢相关调控蛋白的5个基因(kdgR、hexA、hexR、rsmA 和 rsmB)以及编码胞外酶的 6 个基因(pelA、pelB、pelC、pelW、、pehA和pmeB)在转录水平进行了分析。qRT-PCR结果显示,Pba-△eda中调控蛋白的基因与野生型的表达量没有显著差异;然而,Pba-△eda中编码pelC、pelW、pmeB则分别显著下调表达了 8倍、28倍和181倍。此外,Pba-Aeda在马铃薯植株上的定殖能力与野生型相比显著减弱,突变体处理后的每克植物组织中的菌落数在第三天达到最高值105CFU/g,仅为野生型的1/1000。综上所述,ED途径对Pba的致病性并不是必需的,ED途径中Eda对Pba的致病性的影响主要是通过影响胞外果胶酶基因的表达,进而影响Pba在侵染过程中对果胶的利用和在寄主体内的定殖。除了ED 途径外,在Pectofbacterium 中,Embden-Meyerhof-Parnas(EMP)、戊糖磷酸(Pentose Phosphate,PP)、以及果胶降解(PD)途径也是主要的将糖或糖酸转化成丙酮酸的途径。为了探究这四个代谢途径中关键基因在进化过程中是否存在基因缺失和基因水平转移的现象,及这些现象对Pectofbacterium糖代谢途径功能的影响,本研究通过多重序列分析的方法对Pectobacterium及其近缘属菌株(包括11个Pectobacterium菌株,4个Dickeya菌株,6个Pantoea菌株和9个Erwinia菌株)中28个基因位点(10个看家基因和糖代谢4个途径中18个关键基因)进行了系统发育分析。基于10个看家基因的串联序列分析的核心基因组进化树(HK10)结果显示,除了已知的四个类群(Dectobacterium、Cickeya、Patoea和Erwinia)被较好地聚类,来自本研究室保存的6个Pectobacterium菌株的分类地位也得到了确立。Shimodaira-Hasegawa(SH)检验被用来比较每个关键基因的进化树和核心基因进化树(HK10)之间拓扑学结构是否有显著性的差异。在11个Pectobacterium菌株中,发现在3个代谢关键基因中(glk,pehA 和pemA)可能发生了 4次基因水平转移。在Dickeya、Patoea和Erwinia中,PD途径中所有关键基因几乎都发生了基因缺失;而在Pectobacterium中,则主要是ED途径中edd基因的缺失。更重要的是,Pectobacterium菌株PC1和PccS110中pemA基因发生的基因水平转移说明了种间同源重组的存在。因此,基于10个看家基因的序列分析已能够满足构建核心基因组系统发育树的需要,基因缺失的发生与基因功能相关,且基因水平转移可以发生在基础代谢途径中。