研究背景:肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是一种选择性侵犯上、下运动神经元,引起进行性瘫痪和肌肉萎缩的致命性神经系统退行性疾病。其临床上主要表现为肌肉萎缩、无力,并出现腱反射亢进、病理反射等,发病后进行性加重,多因延髓麻痹、呼吸肌无力合并肺部感染而在发病后3～5年内死亡。目前ALS的发病机制尚不清楚,众多实验显示免疫炎症反应在ALS疾病的病理过程中起重要作用。在ALS疾病早期阶段主要以保护性神经免疫炎症调节为主,机体通过释放一些抗炎因子,如IL-4、IL-10和TGF-β等发挥免疫调节作用。在疾病进展到中、晚期,以神经毒性炎症反应占据主导地位,通过释放各种炎症因子TNF-α、IL-6,IL-1β等,损伤神经元。目前由于ALS病因仍不清楚,发病机制错综复杂,因此临床尚缺乏有效的预防和治疗措施。多数研究者主要从药物治疗、基因治疗和干细胞治疗3个方面探索有意义的治疗方法。但是由于有效果的药物极少,基因治疗等在临床试验的结果并不乐观,因此,干细胞治疗成为ALS目前最有前景的治疗策略。同神经干细胞及骨髓间充质干细胞等相比,羊膜间充质干细胞(hAMSCs)具有来源充足,取材方便,无致瘤性,低免疫源性和免疫抑制作用等优点,并且具有更强的增殖能力及干细胞特性等,成为较为理想的免疫赦免细胞,因此,hAMSCs可能为ALS治疗提供一种新的治疗种子细胞,具有潜在的临床应用价值。本课题组前期研究表明,在转基因ALS模型小鼠疾病早期阶段即开始给予多次hAMSCs静脉移植具有治疗作用,能延缓转基因ALS模型小鼠的疾病进展,改善其运动功能,减轻脊髓神经炎症反应,减少运动神经元的丢失;hAMSCs与小胶质细胞体外共培养时,能够明显抑制其增殖和迁移能力,但具体机制仍不清楚。由于临床大多数患者被确诊时已处于疾病的中晚期阶段,因此,在ALS疾病中、晚期阶段给予hAMSCs移植治疗,探索其治疗作用及机制具有重要意义。因此本研究拟以ALS(hSOD1-G93A)转基因模型小鼠为研究对象,将hAMSCs经静脉移植到疾病中、晚期转基因小鼠体内,从干细胞免疫炎症调节的角度,探讨hAMSCs对ALS转基因小鼠的治疗作用机制,从而为临床治疗ALS提供理论依据。目的:从干细胞免疫炎症调节的角度,探讨hAMSCs移植对ALS转基因小鼠中晚期阶段的治疗作用及机制,从而为临床治疗ALS提供理论依据。方法:选取健康剖宫产产妇志愿捐献的新鲜羊膜,采用胰酶和胶原酶消化法及组织块爬出法相结合的方法逐步分离纯化羊膜间质中的hAMSCs。将hSOD1-G93A半合子转基因雄性配种小鼠与雌性同背景小鼠交配繁殖出子代小鼠,用PCR方法鉴定子代小鼠的基因型。将实验小鼠分为3组:hAMSCs治疗组、PBS治疗组和正常对照组,每组12只,在16周龄时各从尾静脉注入约1×106个细胞(重悬于300μlPBS)或300μlPBS。在18周龄时分别取血、脾脏、脊髓(腰膨大)等组织,采用相关方法检测相应指标,分析hAMSCs在免疫炎症调节过程的作用及机制。结果:(1)经ELISA检测,hAMSCs治疗组血清中抗炎因子TGF-β等指标均高于PBS治疗组,炎症因子TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6等指标均低于PBS治,结果有差异,但无明显统计学意义(p>0.05)。(2)经流式细胞仪检测,与PBS治疗组相比,hAMSCs治疗组小鼠脾脏、血液中Foxp3、Tregs、tDC等均升高,具有统计学差异(p<0.05)。(3)经免疫组化检测,hAMSCs治疗组和PBS治疗组脊髓组织内ChAT、NeuN阳性运动神经元数量均低于野生型对照组,而hAMSCs治疗组高于PBS组,但均无统计学差异(p>0.05);脊髓组织内神经胶质细胞标志物GFAP、Iba1在hAMSCs治疗组和PBS治疗组均高于野生型对照组,但PBS组高于hAMSCs治疗组,但均无统计学差异(p>0.05)。结论:在ALS疾病中晚期阶段给予hAMSCs移植治疗,体内抗炎因子TGFβ有升高趋势,炎症因子TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6等有降低趋势,淋巴细胞中Treg,tDC等指标有升高趋势,提示hAMSCs在ALS疾病中晚期阶段具有一定治疗作用。但ALS疾病中晚期病情进展迅速,难以逆转,在此阶段实施干细胞治疗,可能发挥的治疗作用有限,因此难以达到明显的疗效。