【摘 要】
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樱桃（Cerasus pseudocerasus）作为贵州省精品水果产业六大重要水果产业之一,在全省脱贫攻坚和乡村振兴上发挥了重要作用。近年来贵州省主栽樱桃品种玛瑙红、黑珍珠上发生了花变叶、花变绿、丛枝等现象,对贵州樱桃产业造成严重威胁。本文采用分子生物学方法对贵州7个地区樱桃进行植原体检测及鉴定,以期建立高效的检测方法,明确病原菌分类地位及分布,对该病的检测及防控具有重要意义。获得主要结果如下:
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樱桃（Cerasus pseudocerasus）作为贵州省精品水果产业六大重要水果产业之一,在全省脱贫攻坚和乡村振兴上发挥了重要作用。近年来贵州省主栽樱桃品种玛瑙红、黑珍珠上发生了花变叶、花变绿、丛枝等现象,对贵州樱桃产业造成严重威胁。本文采用分子生物学方法对贵州7个地区樱桃进行植原体检测及鉴定,以期建立高效的检测方法,明确病原菌分类地位及分布,对该病的检测及防控具有重要意义。获得主要结果如下:1.贵州樱桃植原体PCR检测技术的建立采用植原体通用引物对R16m F2/R16m R2、R16F2n/R16R2,对感病樱桃植株总DNA进行常规PCR和巢式PCR扩增,结果表明,普通PCR检测的最低模板浓度为3.72x10-2,巢式PCR检测的最低模板浓度为3.72x10-6,其检测灵敏度比普通PCR提高10~4倍;优化后的PCR反应条件为:1.0μL的2.5m M d NTP、0.2μL的5U/μL Taq DNA聚合酶、各0.5μL的10μM上下游引物,退火温度58℃。2.贵州樱桃植原体感染情况的检测对采自贵州省7个地区的86份樱桃材料进行植原体检测,结果显示,纳雍县、福泉市、乌当区样品的植原体检出率高达100%;威宁县、沿河县、大方县分别为40.74%、66.67%和40%。3.贵州樱桃植原体16S r DNA序列分析利用植原体两对通用引物（R16m F2/R16m R、R16F2n/R16R）对感病樱桃样品总DNA进行巢式PCR扩增,同时对目的条带进行克隆、测序及序列分析。获得2条植原体序列长度分别为1251bp和1255bp（GZ-1,GZ-2）。同源性比较表明,GZ-1、GZ-2植原体序列与榆树黄化植原体组（Elm yellows,16Sr V）同源性最高,说明所得序列属于植原体16Sr V组;系统进化分析显示,GZ-1植原体序列属于16Sr V-B亚组成员,GZ-2与16Sr V各亚组均未聚在同一枝上,将GZ-2序列命为新的亚组,虚拟RFLP分析结果同进化树分析结果相一致。4.贵州樱桃植原体LAMP可视化检测方法的建立根据贵州樱桃植原体16S r DNA基因保守序列,设计出4条环介导等温扩增（LAMP）引物。确定反应条件:100m M Mg SO4的体积为1.0μL、10m M d NTPs的体积为3.5μL,8U/μL Bst2.0 DNA聚合酶体积为0.5μL,内引物与外引物浓度比为8:1,反应温度为60℃,反应时间60min,LAMP扩增效果最佳。LAMP方法检测的最低总DNA浓度为3.72x10-4,比常规PCR灵敏度提高100倍。利用建立的LAMP可视化方法对采集的86份樱桃样品进行植原体检测,阳性检出率为34.88%。
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