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苜蓿是豆科植物中主要的牧草类作物之一,是农业和畜牧业的重要经济类作物。截形苜蓿(Medicago truncatula)基因组75%的区域与大豆具有共线性关系,被用于豆科模式植物,其测序工作基本完成,并且以其为背景的遗传转化体系已经完善,为苜蓿基因功能的研究提供了平台。苜蓿广泛分布于世界范围内,受温度、土壤等环境因素影响,不同品种苜蓿的主要生长地区存在很大差异。与截形首蓿相比,黄花苜蓿(Medicago falcata)具有更强的抗寒冷、干旱胁迫及营养缺乏的能力,探索黄花苜蓿抗胁迫的机制能够为苜蓿乃至于豆科植物的分子育种提供新的思路。低温和盐胁迫损伤植物的生长发育,甚至会导致植物死亡,这也是造成农作物减产和经济损失的重要原因。随着自然灾害和污染问题日益严重,耕地面积减少与环境因素导致农作物减产与人类需求的矛盾不断激化。因此完善经济类作物抗胁迫机制研究,通过分子育种获得抗胁迫能力更强的品种,势必为缓解环境造成的压力做出重要贡献。黄花苜蓿有二倍体和四倍体品种,本研究使用的PI502449是主要生长在我国东北地区及俄罗斯的黄花苜蓿二倍体栽培种,具有极强的抗冷能力。本实验室对黄花苜蓿在盐、干旱及低温胁迫条件下的转录本进行检测和分析,构建了在线数据库,为研究黄花苜蓿在胁迫条件下的分子机制提供了有力的数据支持。对该数据库中的信息进行分析,我们发现在黄花苜蓿抗胁迫的调控因子中,NAC和NIP两类转录因子处于整个网络的核心节点。由此,从NAC转录本的数据中,筛选到两个转录因子MfNAC3和MfNAC4。通过qRT-PCR验证这两个基因在胁迫条件下的表达模式,发现MfNAC3受低温、干旱及盐胁迫诱导,而MfNAC4对盐胁迫响应最为显著。NAC类转录因子作为植物特有的最大的转录因子家族,许多成员参与非生物胁迫的应答,但是在苜蓿中NAC对低温和盐胁迫的调控机制研仍不清楚。本研究以截形苜蓿为遗传背景构建过表达MfNAC3的转基因苜蓿材料,发现在低温胁迫条件下,MfNAMC3显著提高了转基因植株的存活率同时显著降低其相对电导率。在经历冷驯化后,MjNAC3同样显著提高转基因植株的存活率。对MfNAC3转基因植株中的冷相关基因表达水平进行检测,发现转基因植株中,MtCBF1-4的表达量均显著提高。分析发现MtCBF4的启动子具有NAC结合元件,通过EMSA实验发现MfNAC3能够结合到MtCBF4的启动子上,并且转基因植株中,MtICE3、MtCAS15和MtCAS31的表达量均显著上调。以上结果说明MfNAC3调控低温胁迫的方式可能是通过对ICE-CBF-CAS信号通路中的关键基因CBF进行调控,从而提高MfNAC3转基因植株的抗冷能力。对黄花苜蓿进行低温胁迫,发现MtCBF4的同源基因MfCBF4受到低温胁迫诱导,由此推测在黄花苜蓿中,MfNAC3也能够通过对CBF的调控参与低温胁迫的应答。然而过表达MfNAC3在截形苜蓿中的同源基因MtNAC3并不能够提高转基因植物的抗冷能力,对这两个蛋白质的氨基酸序列进行分析,发现虽然二者具有极高的同源性,但是在转录激活区域存在少量氨基酸的差异,这种序列上的差异可能导致了蛋白结构之间的不同,从而对其功能产生影响。MfNAC3和MtNAC3在低温胁迫中的不同功能可能是黄花苜蓿和截形苜蓿抗冷性差异的因素之一。以截形苜蓿为遗传背景构建过表达MfNAC4的转基因苜蓿材料,对其在盐胁迫下的功能进行研究,发现在120 mM NaCl条件下MfNAC4转基因植物的根伸长显著高于野生型。对MfNAC4转基因植株中的胁迫相关基因表达水平进行检测,发现转基因植株中盐相关基因MtZpt2-1和MtSrlk的表达量上调最为显著。分析MtZpt2-1的启动子发现了 NAC结合元件,通过EMSA实验发现MfNAC4能够结合到MtZpt2-1启动子上。以上结果说明,MfNAC4响应盐胁迫,并且初步推断MfNAC4通过对盐相关基因MtZpt2-1的调控,从而提高转基因植株的抗盐胁迫能力。本研究对黄花苜蓿中两个NAC转录因子MfNAC3、MfNAC4分别参与低温和盐胁迫条件下的作用机制进行了探索,为苜蓿中NAC转录因子的作用方式提供了新的线索,并且为苜蓿乃至于豆科植物的抗逆育种提供了新的思路。