研究背景女性原始生殖细胞的生理性损耗自出生后即已开始,直至绝经期生殖细胞耗竭、卵巢功能永久丧失。早发性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency,POI）随病情进展,患者卵巢功能较正常女性会提前过渡至低下或耗竭状态。因此在POI疾病形成前的预防和早期治疗会更有意义,但预防和早期治疗的最佳时机尚不明确。团队前期基础研究发现:在造模前和造模中进行电针预处理可能通过调控卵巢颗粒细胞凋亡相关因子Bcl-2和Bax蛋白的表达,对POI大鼠的卵巢功能具有一定保护作用;但不同时机电针预处理对POI大鼠卵巢功能的效应差异和机制不明。团队前期临床研究发现,电针可以改善卵巢功能不全的患者治疗第12周血清FSH、E2和LH水平,在停止治疗12周后仍有持续效应且无副作用。但电针较之其他治疗对卵巢功能不全患者生殖激素影响的区别尚不清楚;本研究分为实验研究和临床研究两部分。实验研究从分子生物学机制角度,揭示不同时机电针预处理对POI大鼠卵巢保护效应的差异和机制,并在确定最佳干预时机的基础上,进一步探讨电针联合促性腺激素释放激素激活剂（Gonadotropin-releasing hormone agonist,GnRH-a）预处理对 POI 大鼠卵巢功能的保护效应和机制,继而开展临床前瞻队列试验,初步探讨电针与中药联合激素替代疗法（HRT）相比对卵巢功能不全患者生殖激素的影响,为针灸防治POI方案的优化提供思路。研究目的实验研究:实验一探索不同时机电针预处理保护POI大鼠卵巢功能的效应差异。实验二探讨电针预处理基于PI3K/Akt/mTOR通路保护POI大鼠卵巢功能的分子机制。实验三比较电针、促性腺激素释放激素激活剂（GnRH-a）以及电针联合GnRH-a预处理保护POI大鼠卵巢功能效应差异与可能机制。临床研究:初步比较电针和药物改善POI患者血清生殖激素水平疗效和安全性的前瞻性队列研究。研究方法实验研究实验一:将动情周期规律的SD雌性大鼠60只随机分为空白对照组、模型组、（造模前电针）电针Ⅰ组、（造模中电针）电针Ⅱ组、（造模后电针）电针Ⅲ组,每组12只。模型组、电针Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组采用去氧乙烯基环己烯（VCD）按80mg/kg体质量（VCD芝麻油溶解体积比1:17）连续腹腔注射15天。电针Ⅰ组、电针Ⅱ组与电针Ⅲ组分别于造模前4周、造模前2周及后2周、造模后4周,电针“中髎”、“天枢”、“子宫”穴,每周5次,每次40min,4周共20次。空白对照组正常饲养,模型组正常造模,不予电针干预。模型组造模成功后处死大鼠。检测各组大鼠体重周变化率,动情周期紊乱情况,卵巢直径与卵巢指数,光镜下查看卵泡形态计算各级卵泡数量,采用TUNEL方法检测细胞凋亡情况,酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清AMH、FSH、E2。实验二将动情周期规律的SD雌性大鼠72只随机分为空白对照组、模型组、电针Ⅰ组、电针Ⅱ组、电针Ⅲ组,PI3k抑制剂（LY294002）联合电针组,每组12只。模型组、电针Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组、抑制剂联合电针组采用VCD连续腹腔注射15天,具体电针方法同实验一。抑制剂联合电针组于每次电针前1h腹腔注射2.5mg/（kg*d）的LY294002溶液,后完成4周电针预处理干预,电针Ⅰ、电针Ⅱ与电针Ⅲ组预处理干预方法同实验一。空白对照组正常饲养,模型组正常造模,不予电针干预。模型组造模成功后处死大鼠。检测卵巢指数,采用Western Blot检测各组PI3k/Akt/mTOR信号通路下游蛋白的表达情况与荧光定量PCR检测通路相关mRNA表达量。实验三将动情周期规律的SD雌性大鼠60只随机分为空白对照组、模型组、电针组、GnRH-a组、电针联合GnRH-a组,每组12只。模型组、电针组、GnRH-a组,电针联合GnRH-a组采用VCD连续腹腔注射15天,具体电针方法同实验一。电针组与电针联合GnRH-a组于造模前4周予电针预处理干预,GnRH-a组与电针联合GnRH-a组在造模用药前2周,皮下注射GnRH-a 0.4ug/次,共注射1次。空白对照组正常饲养,模型组正常造模,不予电针干预。模型组造模成功后处死大鼠。检测各组大鼠体重周变化率,动情周期紊乱情况,卵巢直径与卵巢指数,光镜下查看卵泡形态计算各级卵泡数量,采用TUNEL方法检测细胞凋亡情况,ELISA 法检测血清 AMH、FSH、E2,Western Blot 检测各组 PI3k/Akt/mTOR信号通路下游蛋白的表达情况与荧光定量PCR检测通路mRNA表达量。临床研究自2019年10月-2022年1月在中国中医科学院广安门医院开展一项前瞻性队列研究,收集病人32名,根据患者意愿自主选择电针方案或药物方案（根据患者病情决定是否联合HRT）。电针组17人,仅接受电针干预,每周2-3次,连续3个月;药物组患者15人接受12周中药或12周中药联合HRT治疗。主要结局指标为对比两组患者治疗12周后血清FSH较基线变化的均值,初步探索电针对比药物改善POI患者血清激素的疗效和安全性评价。研究结果实验研究实验一:不同时机电针预处理保护POI大鼠卵巢功能的效应差异①动情周期紊乱比例:模型组、（造模前电针）电针Ⅰ组、（造模中电针）电针Ⅱ组、（造模后电针）电针Ⅲ组动情周期紊乱大鼠情况分别为100%（12/12）、36.4%（4/11）、60%（6/10）、80%（8/10）。②卵巢指数:与空白对照组比较,模型组大鼠的卵巢指数明显降低（P=0.007＜0.01）;与模型组比较,电针Ⅱ组卵巢指数增加,具有统计学意义（P=0.002＜0.01）。电针组间两两比较,电针Ⅰ组与电针Ⅲ组比较,电针Ⅰ组卵巢指数更高（P=0.030＜0.05）;电针Ⅱ组与电针Ⅲ组比较,电针Ⅱ组卵巢指数更高（P=0.042＜0.05）,差异具有统计学意义。③卵巢形态与卵泡计数:卵泡形态结构,与空白对照组比较,模型组窦前卵泡明显减少,闭锁卵泡明显增加,次级卵泡结构破坏,排列松散,局部可见大量炎性细胞浸润,间质腺明显增加;与模型组比较,电针Ⅰ组卵巢损伤程度轻,窦前卵泡、初级卵泡和次级卵泡数稍多于模型组,卵泡周边颗粒细胞层相对完整,卵泡液充实完整。电针Ⅱ组卵巢皮质可见成堆的窦前卵泡,闭锁卵泡数明显减少。电针Ⅲ组局部可见大量闭锁卵泡和少量炎性细胞浸润。比较各级卵泡计数:与空白对照组比较,模型组窦前卵泡比例明显减少,闭锁卵泡比例明显增加（均P＜0.01）;与模型组比较,电针Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组窦前卵泡比例增加,闭锁卵泡比例明显减少（均P＜0.05）,特别是电针Ⅱ组,窦前卵泡比例明显增加,闭锁卵泡比例明显减少（P=0.009＜0.01）。三组间各卵泡计数比例有统计学差异。电针组间两两比较,电针Ⅰ组与电针Ⅱ组比较,电针Ⅱ组窦前卵泡比例更高（P=0.030＜0.05）,闭锁卵泡比例更少（P=0.014＜0.05）;电针Ⅱ组与电针Ⅲ组比较,电针Ⅱ组窦前卵泡比例更高（P=0.021＜0.05）,闭锁卵泡比例更少（P=0.016＜0.05）,差异具有统计学意义。③卵巢组织TUNEL染色检测:较之空白对照组,模型组AOD明显升高（P＜0.01）;较之模型组,电针Ⅰ组与电针Ⅲ组AOD降低（P＜0.05）,电针Ⅲ组明显降低（P＜0.01）。电针组间两两比较,无明显统计学差异（P=0.711＞0.05）。④各组血清激素水平:较之空白对照组,模型组大鼠血清AMH明显减低,血清FSH、LH 水平明显升高（AMH P=0.027＜0.05,FSH P=0.040＜0.05,LH P=0.030＜0.05）;较之模型组,电针Ⅱ组血清AMH、E2明显升高（AMH P=0.034＜0.05,E2 P=0.048＜0.05）,血清 FSH、LH、PROG 水平明显减低（FSH P=0.036＜0.05,LH P=0.033＜0.05,PROG P=0.048＜0.05）。电针 Ⅰ 组与电针 Ⅲ 组血清LH水平减低（P＜0.05）,特别是电针Ⅲ组血清LH水平较之模型组明显减低（P=0.009＜0.01）。各电针组两两比较,三组间各血清激素水平有统计学差异。电针Ⅰ组与电针Ⅱ组比较,电针Ⅱ组血清AMH更高（P=0.043＜0.05）,血清FSH、血清 PROG 更低（FSH P=0.033＜0.05,PROG P=0.033＜0.05）;电针 Ⅱ 组与电针Ⅲ组比较,电针Ⅱ组血清FSH更低（P=0.029＜0.05）;电针Ⅰ组与电针Ⅲ组比较,血清PROG更低（P=0.029＜0.05）,差异具有统计学意义。实验二:不同时机电针预处理通过PI3k/Akt/mTOR通路保护POI大鼠卵巢功能疗效差异的分子机制。第一部分:不同时机电针预处理基于PI3k/Akt/mTOR通路分子机制研究①卵巢组织PI3k/Akt/mTOR通路上下游蛋白表达:较之空白对照组,模型组Bcl-2/Bax 比值降低（P=0.048＜0.05）,p-Akt/Akt 比值降低（P=0.048＜0.05）与 p-mTOR/mTOR 比值增加（P=0.033＜0.05）;较之模型组,电针Ⅰ组Bcl-2/Bax蛋白灰度值比值增加（均P＜0.05）,电针Ⅰ组、电针Ⅱ组、电针Ⅲ组p-Akt/Akt蛋白灰度值比值均增加（均P＜0.05）,特别是电针Ⅲ组增加明显（P＜0.01）。三组间各蛋白灰度值比值有统计学差异。电针组间两两比较,电针Ⅰ组与电针Ⅲ组比较,电针Ⅰ组Bcl-2/Bax比值更高（P=0.041＜0.05）,电针Ⅲ组p-Akt/Akt比值更高（P＜0.01）;电针Ⅰ组与电针Ⅱ组比较,电针Ⅱ组p-Akt/Akt比值更高（P=0.045＜0.05）;电针Ⅱ组与电针Ⅲ组比较,电针Ⅲ组p-Akt/Akt比值更高（P＜0.01）。②荧光定量PCR检测卵巢组织mRNA表达量:较之空白对照组,模型组Akt、mTOR mRNA相对表达量降低（均P＜0.05）;较之模型组,电针Ⅰ组与电针Ⅲ组PI3k、Akt及mTOR mRNA相对表达量升高（均P＜0.05）,特别是电针Ⅲ组的AktmRNA明显升高（均P＜0.01）。电针Ⅱ组与电针Ⅲ组Bcl-2的mRNA明显升高（均P＜0.01）。三组间各mRNA相对表达量相比有统计学差异。电针组间两两比较,电针Ⅰ组与电针Ⅲ组比较,电针Ⅰ组PI3k、Akt、Bcl-2更高（P=0.041＜0.05）;电针Ⅱ组与电针Ⅲ组比较,电针Ⅲ组PI3k、Akt更高（均P＜0.05）,特别是电针Ⅲ组Akt明显升高（P＜0.01）。电针Ⅰ组与电针Ⅱ组mRNA表达量差异无统计学意义（均P＞0.05）。第二部分:基于PI3k/Akt/mTOR通路研究电针预处理分子机制研究:①卵巢指数与子宫指数:与空白对照组比较,模型组子宫指数、卵巢指数明显降低,两者有统计学差异（子宫P=0.044＜0.05,卵巢P=0.036＜0.05）;与模型组比较,电针组卵巢指数明显升高,抑制剂联合电针组子宫指数明显升高,有统计学差异（均P＜0.05）;较之电针组,抑制剂联合电针组子宫指数、卵巢指数均明显升高,有统计学差异（两组均P＜0.05）。②卵巢组织PI3k/Akt/mTOR通路上下游蛋白表达:较之空白对照组,模型组 Bcl-2/Bax（P=0.030＜0.05）与 p-Akt/Akt（P=0.048＜0.05）比值减少明显;较之模型组,电针组Bcl-2/Bax、p-Akt/Akt蛋白比值明显增加（P=0.048＜0.05）,特别是 p-mTOR/mTOR 增加明显（P=0.002＜0.01）;较之电针组,抑制剂联合电针组,Bcl-2/Bax蛋白比值增加,p-Akt/Akt 比值减少（均P＜0.05）,特别是p-mTOR/mTOR 比值明显减少（P=0.003＜0.01）。③荧光定量PCR检测各较之空白对照组,模型组Akt、mTOR、IGF-1 mRNA相对表达量降低（P＜0.05）;较之模型组,电针组Bcl-2、ER-βmRNA相对表达量升高（均P＜0.05）,抑制剂联合电针组IGF-1 mRNA相对表达量升高（P＜0.05）。较之电针组,抑制剂联合电针组Bcl-2、ER-β、IGF-1 mRNA相对表达量升高（P＜0.05）。实验三:电针联合促性腺激素释放激素激活剂（GnRH-a）对POI大鼠卵巢功能的保护效应与可能机制①各组大鼠体重周变化率:与空白对照组比较,模型组造模第1个月、第3个月体重变化幅度明显缩小（均P＜0.05）;与模型组比较,电针组、GnRH-a组与电针联合GnRH-a组在第1-2个月体重增长幅度均略大于模型组（均P＜0.05）,电针组在造模第3个月体重维持增长趋势明显（P=0.045＜0.05）;与电针组比较,GnRH-a组与电针联合GnRH-a组在第1-2个月体重增长幅度与电针组相似,在第3个月,GnRH-a与电针联合GnRH-a组增长幅度明显低于电针组（均P＜0.05）。②动情周期紊乱比例:各组动情周期紊乱情况有所不同,模型组100%（12/12）、电针组 36.4%（4/11）、GnRH-a 组 25%（3/12）、电针联合 GnRH-a 组 3.3%（4/12）。③卵巢指数:空白对照组卵巢色红饱满,而模型组卵巢色暗而深。GnRH-a组和电针联合GnRH-a组卵巢苍白,电针组与电针联合GnRH-a组卵巢颜色略红润优于GnRH-a组。卵巢指数提示较之空白组,模型组卵巢指数降低（P=0.007＜0.01）;较之模型组,电针组卵巢指数升高（P=0.037＜0.05）,均有统计学意义。较之电针组,GnRH-a组和电针联合GnRH-a组卵巢指数更低（P=0.028＜0.05）。④卵泡形态与卵泡计数:与空白对照组比较,模型组卵巢组织窦前卵泡明显减少,闭锁卵泡明显增加,次级卵泡结构破坏,排列松散,局部可见大量炎性细胞浸润,间质腺明显增加;与模型组比较,电针组、电针联合GnRH-a组卵巢损伤程度轻,卵泡周边颗粒细胞层相对完整,卵泡液充实完整。GnRH-a组卵巢皮质可见散在的窦前卵泡,闭锁卵泡数明显减少。各组卵泡计数比例,与空白组比较,模型组窦前卵泡比例明显减少,闭锁卵泡比例明显增加（均P＜0.01）;与模型组比较,电针组、GnRH-a组、电针联合GnRH-a组窦前卵泡比例增加,闭锁卵泡比例明显减少（均P＜0.01）。各预处理组间比较有差异。与GnRH-a组相比,电针联合GnRH-a组初级卵泡比例更低（P＜0.01）。⑤TUNEL凋亡检测:较之空白对照组,模型组AOD明显升高（P＜0.01）;较之模型组,电针组AOD降低（P=0.041＜0.05）,电针联合GnRH-a组明显降低（P＜0.01）。各预处理组AOD两两比较有统计学差异,较之GnRH-a组,电针联合GnRH-a组明显降低（P＜0.01）。⑥各组血清激素水平:较之空白对照组,模型组大鼠血清AMH、PROG明显减低,血清FSH、LH水平明显升高（均P＜0.05）;较之模型组,GnRH-a组血清AMH明显升高,血清LH水平明显降低（P＜0.05）;电针联合GnRH-a组血清AMH明显升高（P＜0.01）,血清FSH、LH水平明显减低（P＜0.05）。预处理组间比较,血清激素水平有差异。其中电针组与GnRH-a组比较,电针组血清PROG更高（P＜0.05）;电针组与电针联合GnRH-a比较,电针联合GnRH-a血清AMH更高（P＜0.01）、血清PROG、FSH水平更低（P＜0.05）;GnRH-a组与电针联合GnRH-a组比较,电针联合GnRH-a组血清AMH更高（P＜0.01）,FSH水平更低（P=0.032＜0.05）。⑦卵巢组织PI3k/Akt/mTOR通路上下游蛋白表达:与空白对照组比较,模型组中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、Bcl-2/B ax蛋白比值降低（均P＜0.05）;与模型组比较,电针组、GnRH-a组与电针联合GnRH-a组p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白比值升高（均P＜0.05）,特别是电针联合GnRH-a组p-Akt/Akt明显升高（P=0.002＜0.01）,Bcl-2/Bax蛋白比值减少（均P＜0.05）;预处理三组两两比较有统计学差异。与电针组比较,GnRH-a组p-mTOR/mTOR 比值略有升高（P=0.039＜0.05）;与GnRH-a组比较,电针组、电针联合GnRH-a组Bcl-2/Bax蛋白比值略增加（均P＜0.05）,电针联合GnRH-a组p-Akt/Akt明显升高（P=0.006＜0.01）。⑧荧光定量PCR检测卵巢组织mRNA表达量:较之空白对照组,模型组Akt、mTOR mRNA相对表达量降低（均P＜0.05）;较之模型组,电针组与电针联合GnRH-a组PI3k、Akt及mTOR mRNA相对表达量升高（均P＜0.05）,特别是电针联合GnRH-a组的AktmRNA明显升高（P＜0.01）。电针联合GnRH-a组Bcl-2的mRNA明显升高（P=0.004＜0.01）。预处理三组两两比较有统计学差异。与电针组比较,电针联合GnRH-a组Bcl-2 mRNA相对表达量略有升高（P=0.037＜0.05）,Akt明显升高（P=0.006＜0.01）;与GnRH-a组比较,电针联合GnRH-a组PI3k、Bcl-2mRNA相对表达量略升高（均P＜0.05）,Akt明显升高（P＜0.01）。临床研究电针对比药物改善POI患者血清激素的疗效和安全性初步比较①主要结局指标为第12周时血清FSH较基线变化差值,经过12周治疗,电针组患者血清FSH较基线减少的差值与药物（中药联合HRT）组未见明显差异（电针组:-13.16（95%CI,-14.49to-11.83）,药物组:-7.71（95%CI,-10.88to-4.54）;组间差值:-5.45（95%CI,-12.79 to 1.89）,P=0.134＞0.05）;②经过 12 周治疗,电针组患者血清E2水平较基线增加的差值与优于药物组（电针组:48.64（95%CI,24.18 to 73.10）,药物组:-57.67（95%CI,-95.76to-19.58）;组间差值:106.31（95%CI,13.81 to 287.87）,P=0.015＜0.05）。③在治疗结束后 12 周,药物组患者血清FSH较基线减少的差值优于电针组（电针组:-8.84（95%CI,-11.09 to-6.59）,药物组:-15.93（95%CI,-18.09 to-13.77）;组间差值:7.09（95%CI,0.51 to 13.04）,P=0.035＜0.05）。④12周电针干预对血清FSH与血清LH影响折线图,从整体趋势上反映,12周的电针干预在降低FSH的效果较之LH更明显。⑤月经情况比较,电针组与药物组相比,经过12周治疗,月经周期略有增加,经期时长略有缩短,经量较治疗前略有增加,组间比较均无统计学差异。⑥妊娠情况:电针组有2人在治疗期成功妊娠,1人（1/14）经IVF-ET受孕,1人（1/14）自然受孕;药物组中1人在治疗期（1/12）自然受孕。3例妊娠病例均已成功产子。⑦安全性评价:在试验过程中有2例患者出现腹部皮下血肿,血肿在2周内完全缓解。药物组2例因服用黄体酮胶丸出现轻度头晕、恶心,调整服药时间症状随即缓解。无其他不良反应被记录。研究结论基础研究1.不同时机电针预处理保护POI大鼠卵巢功能具有效应差异,相较造模后电针预处理,造模前与造模中电针预处理其保护效应更明显。2.不同时机电针预处理保护POI大鼠卵巢功能的效应差异与电针不同程度上调卵巢组织PI3K/Akt/mTOR通路下游分子Akt、mTOR表达,进而不同程度上调Bcl-2和下调Bax有关。3.相较造模前电针预处理或皮下注射GnRH-a预处理,造模前电针联合GnRH-a预处理可更好保护POI大鼠卵巢功能,其机制可能与不同程度上调卵巢组织PI3K/Akt/mTOR通路下游分子Akt、mTOR的表达有关。临床研究12周电针治疗在改善POI患者生殖激素水平上与中药联合HRT治疗相当,疗效可持续至治疗后12周,电针在改善POI患者血清性激素水平上存在一定优势。