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黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosic virus, CGMMV)在世界范围内均有分布,主要侵染葫芦科作物,是葫芦科作物的首要病毒病害,给人们带来巨大的经济损失。CGMMV危害严重,防治困难,至今还没有有效的防治手段。鸦胆子素D(Bruceine D)是从中药鸦胆子(Brucea javanica(L.)Merr)种子中提取得到的,已有研究表明,鸦胆子素D对TMV、CMV、PVY均有很好的抑制作用,本实验对鸦胆子素D抗CGMMV进行活性研究。本实验利用感染CGMMV的黄瓜叶片提取出病毒粒子,成功制备了CGMMV的抗血清,间接ELISA检测其效价为1:16,000。利用感染CGMMV的黄瓜叶片提取总RNA,通过RT-PCR得到CGMMV-MP,并成功克隆到pMD18-T载体上,借助原核表达载体pET-29a构建了重组表达质粒pET-29a-MP,DNA序列分析表明,所得MP基因全长为795 bp,与已报告的CGMMV-GX-MP基因的同源性为100%。IPTG诱导6 h后表达量最大,用超声波破碎后检测到融合蛋白以不可溶形式存在。SDS-PAGE检测蛋白表达情况,表达产物与目的蛋白大小一致,割胶免疫注射家兔得到抗体,间接ELISA检测其效价为1:8,000,western-blot证明抗体特异性良好。在鸦胆子素D抗病毒活性研究中,分别采用半叶法、叶碟法检测了鸦胆子素D对CGMMV侵染和增殖的影响,结果显示,其在10μg/mL的处理浓度下,鸦胆子素D对侵染和增殖的抑制率分别为78.99%和81.05%,另外,在20μg/mL、40μg/mL的浓度下抑制率虽能达到90%,但对寄主植物产生明显的药害,枯斑寄主苋色藜和自然寄主黄瓜的叶片出现了大面积的干枯。通过电镜观察发现鸦胆子素D在体外能够使病毒粒子断裂,采用相对定量PCR试验证明鸦胆子素D能够有效抑制病毒的复制酶基因、运动蛋白基因、外壳蛋白基因的表达,在10μg/mL的处理浓度下对复制酶基因、运动蛋白基因、外壳蛋白基因的抑制率分别为88.77%、92.09%、98.09%。Western-blot,检测结果表明鸦胆子素D对病毒后期运动蛋白、衣壳蛋白的表达也能产生抑制作用。