猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种重要的人兽共患病病原,不仅严重制约着各国养猪业的发展,还威胁着人类的健康。在其现有的33种血清型(1-31型,33型和1/2型)中,以猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)毒力最强,流行最广。目前,猪链球菌病(Swine Streptococcosis)的防治措施主要包括加强管理、接种疫苗和药物防治,然而这些措施的效果有限。随着动物转基因技术的发展,抗病育种方法可为猪链球菌病的防治提供新的思路。1.不同品系小鼠对猪链球菌2型易感性试验小鼠感染SS2后的临床特征与猪感染相似,且不同品系小鼠对SS2的易感性存在差异,可作为动物模型研究猪的感染过程。本试验将B6,A/J和BALB/c三个品系小鼠分别随机分为四组,其中三组作为试验组,每组8-10周龄雌性和雄性小鼠各10只,共20只;剩余一组为对照组,8-10周龄雌性和雄性小鼠各3只,共6只。三组试验组小鼠分别通过腹腔接种1mL剂量为5×107 CFU/mL、1×108 CFU/mL和5×108 CFU/mL的ZY05719菌液;对照组小鼠腹腔接种等量无菌THB培养液,观察并记录各组小鼠死亡情况;对3天内死亡的小鼠立即剖取脑组织进行菌落脏器分布计数,对15天后依然存活的小鼠统一采血测定抗体效价,同时,选取典型症状小鼠制作病理切片,从而确定对ZY05719菌株易感和抗病的小鼠品系以及合适的攻毒剂量。结果表明,在不同攻毒剂量下,B6和BALB/c小鼠对SS2的易感性存在差异,但均不显著,两品系小鼠对SS2均表现出较好的抗病性;当攻毒剂量为1×108 CFU/mL时,B6和A/J小鼠对SS2的易感性具有显著差异,其中A/J小鼠表现为易感,B6小鼠表现为抗病。本试验成功确定了 SS2的易感和抗病小鼠品系,为筛选猪抗猪链球菌病抗病相关基因奠定了基础。2.B6与A/J小鼠杂交F2代对猪链球菌2型易感性的GWAS分析全基因组关联分析是利用统计学工具检测全基因组范围内遗传标记与可观性状间遗传关联的一种有效方法。本试验选择A/J和B6小鼠为亲本,以非近交形式连续杂交两代构建F2代小鼠动物模型。对F2代小鼠每只腹腔注射1×108 CFU ZY05719菌液,根据死亡情况及其他辅助指标筛选抗病样本和易感样本共90个。提取样本基因组DNA,质检合格后处理基因组DNA,设计比对方案,通过Affymetrix(?)Mouse Diversity Genotyping Array扫描分析获得显著SNP位点。从Manhattan图中可以看出,2号染色体的qB、qC1.1区段上有明显聚集的显著关联信号;与其他染色体相比,7号染色体qA1、qE3区段和12号染色体qF2区段的SNP位点也较为显著,可能与小鼠对SS2的易感性有关,应给予重点关注。3.猪链球菌2型感染不同品系小鼠基因表达谱差异分析基因芯片可高通量检测基因的功能及表达情况,还可单独分析基因调控网络中单基因和多基因的调控作用。本试验选用8-10周龄A/J和B6雄性小鼠为动物模型,每个品系小鼠随机分为四组,每组3只小鼠。其中三组小鼠每只小鼠腹腔注射1×108CFUZY05719菌液,分别于攻毒2、4、8h时采血;剩余组小鼠作为空白对照注射等量THB培养液后采血。血液样本提取RNA,质检合格后处理RNA样本,设计比对方案,通过GeneChip(?)Mouse Transcriptome Assay 1.0扫描分析获得差异表达基因。对获得的基因进行通路分析和基因本体分析,结果表明,差异表达基因所参与的通路和功能包括B细胞和T细胞受体信号途径、抗原的处理与递呈、免疫反应调节、金黄色葡萄球菌感染等,与免疫关系密切,可能与抗猪链球菌病抗病性相关,有待进一步研究。4.猪抗猪链球菌病抗病相关基因的分析为深入挖掘猪抗猪链球菌病抗病相关基因,综合SNP芯片结果与基因表达谱芯片结果进行分析。以显著SNP位点上下游500kb区段为拓展区间,筛选该范围内差异表达的基因,获得候选基因集。根据曼哈顿放大图和相关资料进一步挑选可能与抗猪链球菌病抗病相关的基因,利用CRISPR/Cas9基因定点编辑技术对这些基因进行功能验证。ArhGAP15参与调节细胞骨架形态、抑制Rac1蛋白活性等活动,同时与细菌感染密切相关;Epn1作为细胞内吞作用的接头,参与网格蛋白依赖的内吞作用;CD55可通过经典补体途径和替代补体途径抑制攻膜复合体的形成,从而保护细胞免受攻击。选择这三种基因作为目的基因,采用CRISPR/Cas9技术在细胞水平上对其进行敲除,目前已初步获得敲除ArhGAP15的单克隆细胞,为后续基因功能鉴定奠定了基础。