小麦(Triticum aestivumL.)作为禾本科单子叶植物,是全球范围内最重要的粮食作物,也是在我国广泛种植的主要粮食作物。然而,小麦的产量和品质仍不能满足日益增长的人口的需求。各种环境胁迫,包括生物和非生物胁迫,是造成小麦减产的主要因素。目前解决这些问题的手段主要包括改良土壤环境和耕作技术和选育抗性品种,从而提高产量和改善品质。本研究通过筛选和鉴定小麦抗逆新基因,研究这些基因在调控植物抗性上的功能,从而为小麦抗逆育种提供支撑。三磷酸腺苷双磷酸酶基因家族APYRASEs(APYs)编码一种磷酸水解酶,属于GDA1-CD39家族,植物中的Apyrase最先在马铃薯中被分离鉴定,之后被证实广泛存在于动物植物中。目前植物中的相关研究表明,APY参与调控植物的生长发育,同时响应植物的逆境胁迫。在拟南芥中,APY能够有效调节胞外ATP(extracellular ATP,eATP)的水平,防止植物细胞内活性氧(ROS)的过量产生,从而进一步参与调控植物生长与对逆境的抗性。在杨树中,APY直接参与调控植物对干旱和盐碱的抗性。目前,在小麦中尚未见APY相关的研究报道。本研究围绕小麦APY基因家族开展研究,得到以下主要结果:1、借助生物信息学手段,分析了小麦基因组数据及NCBI小麦数据库,确定了小麦TaAPYs基因家族共有九个成员。核酸和蛋白序列分析,结合蛋白高级结构预测表明,小麦的APY各成员间保守程度相对较高,依据亲缘关系以及序列特征分析将九个成员分为三组:I(TaAPYI、TaAPY2、TaAPY3-1、TaAPY3-1、TaAPY3-3和TaAPY3-4),Ⅱ(TaAP5和TaAPY6)和Ⅲ(TaAPY7)。各组内成员的核酸和氨基酸序列、蛋白结构和活性位点都比较保守,并且这九个基因都分别在A、B和D三个染色体组上有拷贝。2、研究了TaAPY 对不同胁迫的响应模式。在非生物胁迫下,小麦APY家族成员的表达量在地上部分普遍上调,并且部分成员对逆境的响应存在特异性,例如TaAPY3-2的表达量在热胁迫下地上部分有明显上调,而在重金属和盐胁迫下则表达量无明显变化;TaAPY3-4在多种逆境下表达量都较高。在生物胁迫下,所有基因都在接种白粉菌(Blumeria graminis)24小时之后产生明显的表达量的上调。这些结果表明,小麦APY参与了小麦对非生物及生物胁迫的响应。3、为了进一步探究小麦APY是否通过降解eATP来参与小麦的抗逆过程,本研究选取了逆境胁迫中表达较为活跃的TaAPY3-1,构建了原核表达载体,并进一步表达纯化出了具有活性的小麦APY蛋白。实验证明TaAPY3-1所编码的小麦APY具有降解ATP的活性,并且在较大的温度范围内都能够保持较高的活性。这一特征可能是APY在小麦耐高温过程中发挥作用的关键。该结果为小麦通过APY来降解胞外ATP来参与植物抗逆提供了强有力的证据。4、构建了AtAPY 和TaAPY5的过表达载体,并进一步进行了转基因功能验证。AtAPY3转基因结果表明,在高盐和高渗透胁迫条件下,过表达AtAPY3的拟南芥株系种子萌发率高于野生型株系,远高于apy3拟南芥突变体;随着NaCl和mannitol浓度的不断升高,各个株系的种子萌发所需时间都逐渐延长,同时萌发率下降,但是与野生型与突变体相比,胁迫对AtAPY3过表达株系的种子萌发抑制作用更小。定量PCR结果表明,过表达株系的TaAPY5表达量极高。与野生型相比,TaAPY5整体外观表现为植株矮小,生长速度缓慢,部分株系下胚轴较长。逆境胁迫实验显示,在低浓度盐胁迫下,过表达TaAPY5株系较野生型根系发达。利用基因枪法将TaAPY5基因转入到小麦中,已获得部分转基因阳性植株。