研究背景:　　 自九十年代Lippy,Ridker等人的研究证明冠脉粥样硬化是一种炎症过程以来,围绕炎症与心血管疾病的基础研究如火如荼。IL-1β是具有代表性的炎症因子,大量文献报道IL-1β与冠心病、心力衰竭、血管痉挛等多种心血管疾病密切相关,而动脉平滑肌细胞膜电位的变化是上述疾病病理过程的共同特征[1-3]。膜电位与细胞代谢、增殖、迁移等多种生物学行为有关。已有报道IL-1β在血管平滑肌细胞、神经细胞、P12细胞、颈动脉体细胞等多种类型细胞中抑制钾通道开放[4-7],进而影响膜电位。血管平滑肌细胞膜电位与平滑肌血管舒缩反应性密切相关。血管平滑肌细胞膜超级化,促使细胞膜上电压依赖性钙通道(VDCC)关闭,外钙内流减少,导致平滑肌舒张,即所谓的超极化舒张机制。超极化舒张机制是内皮源性舒张受损的一种重要补偿机制[8]。血管平滑肌细胞上多种钾通道开放可使细胞膜超极化。大电导钙敏感钾通道(Bkca)是血管平滑肌的优势钾通道,是形成膜电位的重要原因[9-11]。Bkca通道敏感于血管平滑肌细胞内游离Ca2+、活性氧簇(ROS)、三磷酸腺苷(ATP)、蛋白激酶和细胞膜电位等与细胞功能密切相关的重要信[12-17]。从“电-化学”角度推测,IL-1β通过调节血管平滑肌细胞膜电位对细胞生物学产生影响。他汀类药物自1976年上市应用于临床治疗以来,其非调脂作用,近些年来越来越引起人们的重视,一系列国内外大规模、随机、前瞻性研究均表明,他汀类药物能够显著降低心血管事件发病率及死亡率,从而使他汀类药物在心血管疾病预防及治疗中发挥越来越重要的作用。尤其是近些年来随着临床及基础研究的不断深入,发现他汀类药物除调脂作用以外,还具有抑制炎症、改善内皮功能、抗血小板聚集、稳定动脉粥样斑块以及抗心律失常等作用。相对于其调脂作用,他汀类药物具有更强的心血管保护作用,其中他汀类药物抗炎作用正是其调脂外作用的重要内容[18-19]。大量研究认为,他汀类药物通过下调小G蛋白-RHO、上调诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)进而上调细胞内一氧化氮(NO)水平[20],另外他汀类药物作为一种活性氧簇(ROS)清除剂可有效下调细胞内ROS水平。而NO及ROS是确切的Bkca道活性调节制剂[21,22]。已有报道阿托伐他汀可直接开放血管内皮细胞Bkca通道进而调节内皮细胞膜电位[23]。有理由推测,他汀类药物可以调节血管平滑肌细胞Bkca通道并因此调节其膜电位从而发挥生物学作用。目前阿托伐他汀对血管平滑肌细胞Bkca通道活性及其膜电位的影响尚未见报道。本课题运用共聚焦显微镜技术和膜片钳技术,以特异性Bkca通道阻断剂为背景,观察阿托伐他汀对血管平滑肌细胞膜电位及Bkca通道活性影响。并探讨在炎症病理生理情况下,阿托伐他汀能否逆转IL-1β对血管平滑肌细胞膜电位及Bkca通道活性的影响及其可能机制,对丰富他汀类药物适应症,指导临床具有重大意义。　　 研究方法:　　 本课题用阿托伐他汀处理大鼠主动脉平滑肌细胞(ASMCs),观察在生理及炎症病理情况下阿托伐他汀对大鼠ASMC膜电位及Bkca通道的影响。运用激光共聚焦显微镜观察不同浓度阿托伐他汀对大鼠ASMC膜电位的影响,分析在有无IL-1β情况下,阿托伐他汀对大鼠ASMC膜电位的影响,并探讨其中的关联。为了明确阿托伐他汀对BKca通道活性影响,我们运用单通道膜片钳技术内面向外模式检测有或无IL-1β存在时,阿托伐他汀对BKca单通道开放几率Po的作用。全细胞模式下,观察阿托伐他汀对ASMC培养液全细胞钾电流IK的影响及IBTX降低IK幅度变化。此外,阿托伐他汀处理与IL-1β共培养的ASMCs后我们检测细胞内H2O2动态变化。　　 研究结果:　　 1、生理情况下阿托伐他汀对大鼠主动脉平滑肌细胞膜电位及大电导钙敏感钾通道活性影响的研究　　 (1)生理情况下阿托伐他汀对ASMCs膜电位的影响　　 ①ASMCs与各浓度组阿托伐他汀(10、25、50、100、150umol/L)共培养6h后,与对照组(saline组)比较,膜电位超级化,表现为细胞荧光值下降,且下降呈阿托伐他汀浓度依赖性,在阿托伐他汀100umol/L组表现出最大效应。②我们引入BKea通道的特异性阻断剂IBTX(100nM),运用激光共聚焦显微镜观察对照组(control组)、100umol/L阿托伐他汀处理组、IBTX处理组、100umol/L阿托伐他汀+IBTX处理组,各组作用下细胞膜电位变化。结果表明,IBTX完全阻断了阿托伐他汀对ASMCS膜电位的影响,说明BKca通道介导阿托伐他汀对ASMCs膜电位调节作用。　　 (2)生理情况下阿托伐他汀对IBTX敏感的全细胞钾电流影响　　 以电流密度(PA/PF)为指标,以钳制电压为+50mv为例。Saline组内,+IBTX时电流密度较-IBTX时减小有统计学意义,表明BKca通道是ASMCs生理状态下钾电流的重要组成部分。在全细胞膜片钳试验中,我们发现阿托伐他汀组全细胞钾电流明显增大有统计学意义(与saline组比较),且此增大电流对IBTX敏感。表现为阿托伐他汀组内,+IBTX时电流密度较-IBTX时减小有统计学意义。这表明阿托伐他汀处理ASMCs时全细胞钾电流增加,Bkca通道电流增加参与其中。　　 (3)生理情况下阿托伐他汀调节ASMCs上BKca单通道活性　　 以开放概率Npo为指标,观察+/-atorvastatin时BKca通道单通道活性变化。Atorvastatin处理组,与saline组比较,Npo明显增加,有统计学意义。　　 2、炎症病理情况下阿托伐他汀对大鼠主动脉平滑肌细胞膜电位及大电导钙敏感钾通道活性影响的研究　　 (1)阿托伐他汀可以完全逆转IL-1β引起的ASMCs细胞内H2O2水平的升高　　 H2O2检测试剂盒检测50ng/mlIL-1β处理ASMCs12h后细胞内H2O2水平,与control比较,H2O2增加有统计学意义;catalasc(H2O2清除剂,200U/ml)+IL-1β处理组,catalase可完全逆转IL-1β引起的ASMCs细胞内H2O2水平的升高;atorvastatin(100umol/L)+IL-1β处理组,atorvastatin同样可完全逆转IL-1β引起的ASMCs细胞内H2O2水平的升高;catalase与atorvastatin无协同作用,IL-1β+catalaSe+atorvastatin处理组与IL-1β+atorvastatin处理组比较,H2O2变化无统计学意义;IL-1β处理组与control组比较,H2O2水平增加有统计学意义;而其它三组(IL-1β+catalaSe处理组,IL-1β+atorvastatin处理组,IL-1β+catalaso+atorvastatin处理组)与control组比较,均无统计学意义。　　 (2)阿托伐他汀可以完全逆转IL-1β引起的ASMCs去极化　　 结果显示,与对照组比较,IL-1β处理组,S0ng/L的IL-1β与ASMCs共培养12h明显使AsMCs膜去极化;catalase(H2O2清除剂,200U/ml)+IL-1β处理组,catalase可以完全逆转IL-1β引起的ASMCs膜去极化;atorvastatin(100umol/L)+IL-1β处理组,atorvastatin不仅可以完全逆转IL-1β引起的ASMCs膜去极化,而且在某种程度上可以引起ASMCs膜超极化;atorvastatin+catalase+IL-1β处理组,atorvastatin+catalase亦可不仅完全逆转IL-1β引起的ASMCs膜去极化,而且在某种程度上引起ASMCs膜超极化,而且与atorvastatin+IL-1β处理组比较,两组没有协同效应。　　 (3)炎症病理情况下阿托伐他汀调节ASMCs上BKca单通道活性　　 以开放概率(Npo)为指标,观察+/-atorvastatin(10umol/L)及+/-catalase(H2O2清除剂,200u/ml)时IL-1β(50ng/L的IL-1β与ASMCs共培养12h)对BKca通道单通道活性影响。IL-1β单独处理组,与saline组比较,Npo明显减少,有统计学意义。IL-1β+catalase处理组,与saline组比较,Npo改变无统计学意义;与IL-1β单独处理组比较,Npo明显增加,有统计学意义。Atorvastatin单独处理组,与saline组比较,Npo明显增加,有统计学意义;与IL-1β单独处理组比较,Npo明显增加,有统计学意义。IL-1β+atorvastatin处理组,与saline组比较,Npo增加有统计学意义;与IL-1β单独处理组比较,Npo明显增加,有统计学意义。IL-1β+catalase+atorvastatin处理组,与saline组比较,Npo增加有统计学意义;与IL-1β单独处理组比较,Npo明显增加,有统计学意义;与IL-1β+atorvastatin处理组比较,Npo变化无统计学意义;说明catalaLse与atorvastatin两者没有协同作用。　　 结论:　　 1、生理情况下阿托伐他汀下调ASMCs膜电位,即使平滑肌细胞超极化,且此调节具有浓度依赖性特征,阿托伐他汀浓度为100umol/L时影响最大;　　 2、生理情况下阿托伐他汀可直接开放血管平滑肌细胞BKca通道,进而影响ASMCs膜电位:　　 3、炎症病理情况下IL-1β上调ASMCs内H2O2水平,而阿托伐他汀可以完全逆转IL-1β引起的H2O2水平的升高;　　 4、12小时50ng/mIL-1β的处理使ASMCs细胞膜去极化,而100umol/L阿托伐他汀可以逆转IL-1β引起的ASMCs去极化;阿托伐他汀逆转IL-1β对血管平滑肌细胞膜电位的影响是部分通过直接开放血管平滑肌细胞BKca通道,部分通过下调细胞内H2O2水平介导的;　　 5、12小时50ng/mlIL-1β的处理抑制ASMCs细胞膜上BKca通道活性,而10umol/L阿托伐他汀可以逆转IL-1β对BKca通道活性的影响;阿托伐他汀逆转IL-1β对BKca通道活性的影响是部分通过直接开放血管平滑肌细胞BKca通道,部分通过下调细胞内H2O2水平介导的;　　 6、BKca通道是形成血管平滑肌细胞膜电位重要原因;膜电位与心血管疾病密切相关,BKca通道可能是心血管疾病新的药物靶点,阿托伐他汀可能成为直接开放血管平滑肌细胞BKca通道新的药物。