论文部分内容阅读
目的:研究HIV派生的miR99能否引起巨噬细胞内自噬及对自噬功能的影响,从而进一步对HIV慢性免疫激活的机制进行探讨。方法:1.巨噬细胞获得:人单核细胞白血病细胞(THP-1)在佛波酯(PMA)刺激48小时后分化为贴壁巨噬细胞,倒置光学显微镜下观察细胞形态以鉴定。2.将巨噬细胞分为实验组(miR99组)、雷帕霉素组(RP组)、空白对照组,每组处置分别为加miR99、加雷帕霉素、不加任何试剂。每组均设置重复组。3.在各组处置后的第2、4、8、12、24小时等时间点取各组细胞裂解提取蛋白;重复组于8小时时刮取细胞,离心制细胞团保存于3%戊二醛内,交校内电镜教研室制标本。4.透射电镜下察看各组时间点自噬小体数并计数;Western blot方法检测自噬相关蛋白P62及LC3Ⅱ,Image J软件行半定量分析。5.收集资料,分析比较各组结果。结果:1.PMA刺激48小时后悬浮的THP-1细胞绝大部分转变为多边形的、贴壁巨噬细胞。2.透射电镜下观察,比之于空白对照组,RP组及miR99组自噬小体显著增多(P<0.05),RP组及miR99组自噬小体相比无显著差异(P>0.05)。3.目标蛋白的表达:(1)RP组:相较于空白对照组,LC3-Ⅱ的表达随时间(2h、4h、8h、12h、24h)递增(LC3-Ⅱ,P<0.05);P62随时间(2h、4h、8h、12h、24h)递减(P62,P<0.05)(2)mi R99组:相较于空白组,LC3Ⅱ的表达随时间(2h、4h、8h、12h、24h)递增(P<0.05),P62于各时段几乎无变化(P>0.05)。(3)miR99组与RP组相比较,LC3-Ⅱ的表达均随时间进展而递增,但miR99组的P62不随时间变化。结论:1.miR99引起巨噬细胞内自噬发生。2.miR99抑制巨噬细胞内自噬的降解功能。3.自噬体可能是巨噬细胞内HIV的储存库之一。4.对自噬功能的影响可能参与HIV慢性免疫激活的机制。