【摘 要】
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生物偶联反应是医药用材料功能化的关键手段。其中,能够调控表界面生物功能分子密度和取向的偶联方法能够提升材料的性能,在蛋白质层析、生物传感、酶固定、药物输送及医疗成像等领域具有广泛应用。然而,可控性生物偶联方法普遍存在以下缺点:反应活性低、可控性差、选择性不佳、普适性低,且密度调控和取向调控难以同时实现。针对上述难题,本文以乙烯基砜(VS)偶联反应为例,开展了生物偶联反应可控性的研究,实现了对材料表
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生物偶联反应是医药用材料功能化的关键手段。其中,能够调控表界面生物功能分子密度和取向的偶联方法能够提升材料的性能,在蛋白质层析、生物传感、酶固定、药物输送及医疗成像等领域具有广泛应用。然而,可控性生物偶联方法普遍存在以下缺点:反应活性低、可控性差、选择性不佳、普适性低,且密度调控和取向调控难以同时实现。针对上述难题,本文以乙烯基砜(VS)偶联反应为例,开展了生物偶联反应可控性的研究,实现了对材料表界面上生物功能分子密度与取向的调控,对标传统方法和商业产品,显著提高了层析树脂、生物传感芯片及主动靶向纳米粒子的性能。首先,本论文发展了一种基于Michael加成的催化反应,实现了二乙烯基砜(DVS)对琼脂糖树脂羟基的可控活化。从一系列有机碱中筛选出三苯基膦(PPh3)具有最高催化活性,活化密度达到157.5±1.2 μmol/g,是传统碱性水溶液活化条件的2.5倍。并且该方法有效避免了 VS基团在碱性水溶液条件下与水分子的加成反应。以人免疫球蛋白(hIgG)和牛血清白蛋白(BSA)分别作为目标蛋白和杂蛋白,巯乙基吡啶(MEP)偶联配基密度的研究显示,hIgG结合强度随配基密度逐渐升高,抗非特异性吸附能力则先升高后降低。对树脂的等温吸附和动态结合的研究显示,制备的高MEP密度树脂展现出了对hIgG的高结合强度、高特异性和高动态结合载量。并且在奥马珠单抗纯化实验中展示出了较MEP HyperCel?高66%的纯化产量。在此基础上,本文发展了含氨基配基在VS表面的密度调控方法。以N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸(ab-NTA)作为模型配基,筛选出吡啶二甲酸为最佳催化剂。通过调控反应进程实现了对ab-NTA密度在0.34-1.88分子/nm2范围内的调控。对组氨酸标签蛋白和BSA的表面结合过程研究显示,基于DPA催化法制备的ab-NTA芯片在保持高结合特异性的基础上,对组氨酸标签蛋白的最大结合量是琥珀酰亚胺酯(NHS酯)法的1.5倍。基于氨基酸残基亲核反应的差异,发展了一种组氨酸标签蛋白定点共价固定新方法。分别通过溶液反应和表面反应验证了在pH 7.0水溶液条件下,VS基团与组氨酸中咪唑残基反应的高特异性。以两种组氨酸标签蛋白(酶和抗体片段)和BSA作为模型蛋白,与琥珀酰亚胺/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(NHS/EDC)随机固定法和Ni2+-NTA金属配位定点偶联法进行对比,所发展的方法具有固定量高、特异性强、稳定性高的优点。并分别通过蛋白偶联实验和抗原结合实验进一步证明了上述两种组氨酸标签蛋白在表面的定点偶联。综合以上工作,构筑了一种靶向HER2阳性乳腺癌细胞的主动靶向二氧化硅纳米粒子。基于组氨酸标签蛋白在VS表面的定点固定方法保持了表面抗体片段的高抗原结合活性。通过调控DVS活化反应条件,实现了密度在50-180抗体分子/纳米粒子范围内的调控。在表面设计的PEG层和高Fab密度协同作用下,该体系展现出了抗蛋白冠干扰与抗巨噬细胞内吞性能。通过选择三种不同HER2表达水平的乳腺癌细胞株进行的体外研究,Fab密度及细胞HER2表达量的升高均能提高靶向性能,并加快细胞响应。综上所述,本文成功展示了一系列表面乙烯基砜偶联反应的可控性,进而提升了生物材料的蛋白纯化和固定的性能,同时实现了对蛋白质分子的密度调控和定点偶联。本论文的研究满足了医药材料功能化对生物偶联化学的迫切需求,拓展了其在生物传感、药物输送、蛋白纯化、酶固定及医疗成像中的应用。
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