【摘 要】
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羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(Orf Virus,ORFV)引起羊一种以鼻孔嘴唇处出现脓疱以及丘疹为特征的传染病。ORFV 011和ORFV 059编码的B2L和F1L蛋白能够诱导保护性免疫反应,是研制羊口疮病毒亚单位疫苗的主要候选基因。铁蛋白纳米颗粒常被用来作为抗原支架,可以提高亚单位疫苗的免疫原性。1、羊口疮病毒B2L和F1L多肽片段重组载体的构建和表达:根据Orf virus NZ2株(G
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羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(Orf Virus,ORFV)引起羊一种以鼻孔嘴唇处出现脓疱以及丘疹为特征的传染病。ORFV 011和ORFV 059编码的B2L和F1L蛋白能够诱导保护性免疫反应,是研制羊口疮病毒亚单位疫苗的主要候选基因。铁蛋白纳米颗粒常被用来作为抗原支架,可以提高亚单位疫苗的免疫原性。1、羊口疮病毒B2L和F1L多肽片段重组载体的构建和表达:根据Orf virus NZ2株(Gen Bank:DQ184476.1)的B2L以及F1L基因序列设计引物,扩增目的基因B2L以及F1L,并分别与铁蛋白基因融合,PCR串联连接至原核表达载体p ET-28a中,获得p ET-Fe-F1L和p ET-Fe-B2L,将载体p ET-Fe-F1L单酶切连接B2L基因,获得p ET-Fe-F1L-B2L。将测序正确的三个重组质粒转化BL21(DE3)细胞,使用IPTG对Fe-F1L,Fe-B2L和Fe-F1L-B2L重组蛋白进行诱导表达。蛋白质印迹证实了重组蛋白Fe-F1L,Fe-B2L和Fe-F1L-B2L的高表达,可溶性分析确定重组蛋白Fe-F1L,Fe-B2L和Fe-F1L-B2L主要以包涵体存在,然后使用尿素纯化的方式纯化包涵体蛋白。Western blotting结果显示,表达重组蛋白Fe-F1L,Fe-B2L和Fe-F1L-B2L均具有良好反应原性。2、羊口疮病毒B2L和F1L多肽疫苗的免疫原性分析:首先,将纯化的重组蛋白Fe-F1L,Fe-B2L和Fe-F1L-B2L制备成多肽疫苗。然后,将5周龄BALB/c雌鼠共40只,随机分成5组。最后,用多肽疫苗免疫小鼠。在免疫后的第三周,对各试验组的BALB/c鼠,进行静脉采血分离血清。然后,进行ORFV特异性抗体水平,以及细胞因子(IL-4和IFN-γ)的分泌水平进行检查。结果表明,重组蛋白Fe-F1L,Fe-B2L和Fe-F1L-B2L均可诱导实验鼠产生抗羊口疮病毒的特异性抗体产生,且抗体水平及其显著高于PBS组(P<0.01);IL-4和IFN-γ的分泌水平也显著高于PBS组(P<0.05),说明本研究构建的羊口疮铁蛋白纳米颗粒疫苗具有良好免疫原性,能够有效诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫。综上所述,本研究构建了三种重组表达质粒p ET-Fe-F1L,p ET-Fe-B2L和p ET-Fe-F1L-B2L,可以在大肠杆菌中高水平表达羊口疮病毒的抗原蛋白Fe-F1L,Fe-B2L和Fe-F1L-B2L,在此基础上研制的铁蛋白纳米颗粒多肽疫苗,能够诱导诱导试验鼠产生针对羊口疮病毒的特异性抗体和高水平的细胞免疫应答。本研究为进一步开发羊口疮病毒的基因工程疫苗奠定了基础。
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