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第一部分：IL-6/STAT3通过调控PSCs活化对胰腺纤维化的影响
【目的】
观察STAT3信号通路抑制剂S31-201(NSC)对小鼠CP胰腺纤维化以及PSCs活化影响，探究IL-6/STAT3信号通路调控PSCs活化及胰腺纤维化的机制。
【方法】
1、在体实验：
通过腹腔注射Caerulein复制小鼠CP模型，于造模1周后，给予10mg/kg的NSC腹腔注射治疗，于相应时间点麻醉处死小鼠，完整摘取胰腺组织。HE及Masson染色法观察胰腺组织形态学及纤维化改变；免疫组织化学染色法检测STAT3、p-STAT3的改变；免疫组织荧光双重染色法检测胰腺组织α-SMA与IL-6R及α-SMA与p-STAT3的改变；real-timePCR检测胰腺组织FN、TIMP-1mRNA的改变；Westernblot法检测胰腺组织IL-6R、COL3A1、STAT3、p-STAT3蛋白的改变。
2、离体实验：
分离健康C57BL/6小鼠的PSCs，用含20%胎牛血清的DMEM培养基培养，取第二代PSCs进行实验。采用10ng/ml的IL-6刺激细胞，并给予10μM的NSC进行干预，于0h、6h、12h、24h、48h五个时间点收集细胞。油红“O”染色法检测PSCs中脂滴的变化；real-timePCR检测α-SMA、FN、MMP-2mRNA的改变；Westernblot检测α-SMA、IL-6R、COL1A1、STAT3、p-STAT3蛋白的改变。
【结果】
1、在体实验
(1)NSC对CP小鼠胰腺纤维化的影响
HE及Masson染色显示：造模2周时，胰腺组织出现腺泡萎缩、胰腺小叶水肿、炎性细胞浸润等急性炎症的表现；4周时，腺泡萎缩被管状结构或纤维组织所取代；6周时，可见胰腺小叶结构破坏严重、大量纤维组织沉积。通过Westernblot和real-timePCR检测胰腺组织纤维化指标COL3A1、FN及TIMP-1的表达显示：随造模时间的延长，COL3A1蛋白表达水平及FN和TIMP-1mRNA的表达呈明显上升趋势(p＜0.01)。而NSC治疗组小鼠与同时间点的CP模型组相比，胰腺损伤程度明显较轻，纤维化沉积明显减少，COL3A1的蛋白表达水平及FN和TIMP-1的mRNA表达水平也明显受到抑制(p＜0.01)。
(2)NSC对胰腺组织STAT3信号通路的影响
免疫组织化学染色及Westernblot结果显示，CP模型组在2W时，胰腺组织中p-STAT3的表达开始上升(p＜0.01)，4W时持续上升(p＜0.01)，而NSC治疗组胰腺组织中p-STAT3的表达，在累积6W治疗后明显降低(p＜0.01)。
(3)NSC对胰腺星状细胞中IL-6R及p-STAT3表达的影响
免疫组织荧光双重染色结果显示，随造模时间的延长，CP模型组α-SMA的表达持续上升，IL-6R、p-STAT3的表达也明显增加，且可见IL-6R与α-SMA及p-STAT3与α-SMA的共表达区域；而NSC治疗组胰腺组织α-SMA、IL-6R、p-STAT3的表达低于同时间点的CP模型组，并且可见α-SMA/IL-6R及α-SMA/p-STAT3的共表达较同时间点的CP模型组有所减少。
2、离体实验：
分离原代PSCs后第3、5天可见PSCs中含有大量的脂滴，PSCs传代后第1、3、5天仍含有大量的脂滴，提示传代对细胞的活性影响不明显。采用不同浓度IL-6刺激PSCs后α-SMA、FNmRNA的表达均升高，以10ng/mlIL-6刺激24h最为显著(p＜0.01)；继之采用10ng/mlIL-6刺激PSCs，发现IL-6刺激6h即可见到α-SMA、FNmRNA及IL-6R、p-STAT3蛋白明显升高(p＜0.05)，24h时最为显著(p＜0.01)，而48h时表达回归正常水平。同时IL-6刺激PSCs24h后可见，α-SMA、COL1A1蛋白表达水平升高(p＜0.01)，而MMP-2的表达明显降低(p＜0.01)。给予NSC干预后，PSCs表达α-SMA及COL1A1蛋白的水平较IL-6刺激组明显下降(p＜0.01)，但MMP-2的水平明显升高。
【结论】
1、Caerulein诱发的小鼠CP模型可见胰腺组织STAT3活化，NSC可以通过降低胰腺组织STAT3的活化程度，减轻CP的胰腺损伤程度，提示：STAT3是参与CP进展的重要信号通路和治疗靶点。
2、CP进展过程中，可见IL-6R与α-SMA及p-STAT3与α-SMA的共表达，提示：PSCs活化可能受到IL-6/STAT3信号通路的调控。
3、IL-6可刺激PSCs活化并促进IL-6受体(IL-6R)的表达，进而激活STAT3信号通路，导致PSCs活化；遏制STAT3可降低PSCs活化程度，证实IL-6/STAT3是调控PSCs活化的信号通路。
第二部分：大柴胡汤对CP胰腺纤维化的防治作用
【目的】
观察大柴胡汤对CP小鼠的治疗作用及对STAT3信号通路的影响，探讨大柴胡汤治疗CP的作用机制。
【方法】
通过腹腔注射Caerulein复制小鼠CP模型，于造模1周后开始给予140μ1/l0g的大柴胡汤灌胃治疗，于造模及治疗后对应的时间点，分别麻醉处死小鼠，完整摘取胰腺组织，HE及Masson染色法检测胰腺组织形态学及纤维化改变；免疫组织化学染色检测胰腺组织STAT3、p-STAT3的改变。
【结果】
1、大柴胡汤对CP胰腺组织病理学的影响
HE及Masson染色结果显示：造模2周时，胰腺组织出现胰腺小叶水肿、炎性细胞浸润、腺泡萎缩等表现；4周时，炎细胞浸润增多、腺泡萎缩或消失、胰腺组织空泡样坏死，胶原纤维逐渐增多，形成纤维化；6周时，可见胰腺组织坏死、胰腺小叶结构破坏严重、胰腺纤维化已取代正常胰腺组织。而大柴胡汤治疗组小鼠的胰腺损伤及纤维化程度明显较轻，仅可见少量的腺泡萎缩、炎症细胞浸润及胶原纤维组织。
2、大柴胡汤对不同时间点胰腺组织中STAT3、p-STAT3表达的影响
免疫组化结果显示，随造模时间的延长，模型组小鼠胰腺组织中p-STAT3的阳染表达明显增多，呈持续上升趋势，而大柴胡汤治疗组胰腺组织p-STAT3的阳染表达明显降低。
【结论】
大柴胡汤可以显著降低CP的病理损伤及纤维化程度，其机制可能与遏制STAT3信号通路有关。
【目的】
观察STAT3信号通路抑制剂S31-201(NSC)对小鼠CP胰腺纤维化以及PSCs活化影响，探究IL-6/STAT3信号通路调控PSCs活化及胰腺纤维化的机制。
【方法】
1、在体实验：
通过腹腔注射Caerulein复制小鼠CP模型，于造模1周后，给予10mg/kg的NSC腹腔注射治疗，于相应时间点麻醉处死小鼠，完整摘取胰腺组织。HE及Masson染色法观察胰腺组织形态学及纤维化改变；免疫组织化学染色法检测STAT3、p-STAT3的改变；免疫组织荧光双重染色法检测胰腺组织α-SMA与IL-6R及α-SMA与p-STAT3的改变；real-timePCR检测胰腺组织FN、TIMP-1mRNA的改变；Westernblot法检测胰腺组织IL-6R、COL3A1、STAT3、p-STAT3蛋白的改变。
2、离体实验：
分离健康C57BL/6小鼠的PSCs，用含20%胎牛血清的DMEM培养基培养，取第二代PSCs进行实验。采用10ng/ml的IL-6刺激细胞，并给予10μM的NSC进行干预，于0h、6h、12h、24h、48h五个时间点收集细胞。油红“O”染色法检测PSCs中脂滴的变化；real-timePCR检测α-SMA、FN、MMP-2mRNA的改变；Westernblot检测α-SMA、IL-6R、COL1A1、STAT3、p-STAT3蛋白的改变。
【结果】
1、在体实验
(1)NSC对CP小鼠胰腺纤维化的影响
HE及Masson染色显示：造模2周时，胰腺组织出现腺泡萎缩、胰腺小叶水肿、炎性细胞浸润等急性炎症的表现；4周时，腺泡萎缩被管状结构或纤维组织所取代；6周时，可见胰腺小叶结构破坏严重、大量纤维组织沉积。通过Westernblot和real-timePCR检测胰腺组织纤维化指标COL3A1、FN及TIMP-1的表达显示：随造模时间的延长，COL3A1蛋白表达水平及FN和TIMP-1mRNA的表达呈明显上升趋势(p＜0.01)。而NSC治疗组小鼠与同时间点的CP模型组相比，胰腺损伤程度明显较轻，纤维化沉积明显减少，COL3A1的蛋白表达水平及FN和TIMP-1的mRNA表达水平也明显受到抑制(p＜0.01)。
(2)NSC对胰腺组织STAT3信号通路的影响
免疫组织化学染色及Westernblot结果显示，CP模型组在2W时，胰腺组织中p-STAT3的表达开始上升(p＜0.01)，4W时持续上升(p＜0.01)，而NSC治疗组胰腺组织中p-STAT3的表达，在累积6W治疗后明显降低(p＜0.01)。
(3)NSC对胰腺星状细胞中IL-6R及p-STAT3表达的影响
免疫组织荧光双重染色结果显示，随造模时间的延长，CP模型组α-SMA的表达持续上升，IL-6R、p-STAT3的表达也明显增加，且可见IL-6R与α-SMA及p-STAT3与α-SMA的共表达区域；而NSC治疗组胰腺组织α-SMA、IL-6R、p-STAT3的表达低于同时间点的CP模型组，并且可见α-SMA/IL-6R及α-SMA/p-STAT3的共表达较同时间点的CP模型组有所减少。
2、离体实验：
分离原代PSCs后第3、5天可见PSCs中含有大量的脂滴，PSCs传代后第1、3、5天仍含有大量的脂滴，提示传代对细胞的活性影响不明显。采用不同浓度IL-6刺激PSCs后α-SMA、FNmRNA的表达均升高，以10ng/mlIL-6刺激24h最为显著(p＜0.01)；继之采用10ng/mlIL-6刺激PSCs，发现IL-6刺激6h即可见到α-SMA、FNmRNA及IL-6R、p-STAT3蛋白明显升高(p＜0.05)，24h时最为显著(p＜0.01)，而48h时表达回归正常水平。同时IL-6刺激PSCs24h后可见，α-SMA、COL1A1蛋白表达水平升高(p＜0.01)，而MMP-2的表达明显降低(p＜0.01)。给予NSC干预后，PSCs表达α-SMA及COL1A1蛋白的水平较IL-6刺激组明显下降(p＜0.01)，但MMP-2的水平明显升高。
【结论】
1、Caerulein诱发的小鼠CP模型可见胰腺组织STAT3活化，NSC可以通过降低胰腺组织STAT3的活化程度，减轻CP的胰腺损伤程度，提示：STAT3是参与CP进展的重要信号通路和治疗靶点。
2、CP进展过程中，可见IL-6R与α-SMA及p-STAT3与α-SMA的共表达，提示：PSCs活化可能受到IL-6/STAT3信号通路的调控。
3、IL-6可刺激PSCs活化并促进IL-6受体(IL-6R)的表达，进而激活STAT3信号通路，导致PSCs活化；遏制STAT3可降低PSCs活化程度，证实IL-6/STAT3是调控PSCs活化的信号通路。
第二部分：大柴胡汤对CP胰腺纤维化的防治作用
【目的】
观察大柴胡汤对CP小鼠的治疗作用及对STAT3信号通路的影响，探讨大柴胡汤治疗CP的作用机制。
【方法】
通过腹腔注射Caerulein复制小鼠CP模型，于造模1周后开始给予140μ1/l0g的大柴胡汤灌胃治疗，于造模及治疗后对应的时间点，分别麻醉处死小鼠，完整摘取胰腺组织，HE及Masson染色法检测胰腺组织形态学及纤维化改变；免疫组织化学染色检测胰腺组织STAT3、p-STAT3的改变。
【结果】
1、大柴胡汤对CP胰腺组织病理学的影响
HE及Masson染色结果显示：造模2周时，胰腺组织出现胰腺小叶水肿、炎性细胞浸润、腺泡萎缩等表现；4周时，炎细胞浸润增多、腺泡萎缩或消失、胰腺组织空泡样坏死，胶原纤维逐渐增多，形成纤维化；6周时，可见胰腺组织坏死、胰腺小叶结构破坏严重、胰腺纤维化已取代正常胰腺组织。而大柴胡汤治疗组小鼠的胰腺损伤及纤维化程度明显较轻，仅可见少量的腺泡萎缩、炎症细胞浸润及胶原纤维组织。
2、大柴胡汤对不同时间点胰腺组织中STAT3、p-STAT3表达的影响
免疫组化结果显示，随造模时间的延长，模型组小鼠胰腺组织中p-STAT3的阳染表达明显增多，呈持续上升趋势，而大柴胡汤治疗组胰腺组织p-STAT3的阳染表达明显降低。
【结论】
大柴胡汤可以显著降低CP的病理损伤及纤维化程度，其机制可能与遏制STAT3信号通路有关。