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研究背景:
近年来，随着健康知识宣教与普及，越来越多的年轻群体已经开始注意心脏系统的保护与疾病预防，冠脉临界病变作为冠心病的初始阶段，日益受到人们的关注。冠心病冠脉临界病变是指行冠状动脉造影后，其狭窄程度在30-70%的病变。冠脉临界病变是冠心病的发展的初始阶段，该阶段中患者体征较不明显或无体征，一般认为在冠状动脉狭窄程度小于70%的状态下，多对患者采取药物干预为主，而中医药的干预十分有意义。
冠心病冠脉临界病变的中医证候分析可认为跟“痰”“热”“瘀”有关，现代人滋食肥甘厚腻之品，又缺乏适当运动，脾胃不运则水谷积聚，而生污浊之痰；加以空气污浊，雾霾颗粒密度较高，而又吸食烟草，病邪从肺而入，伤及肺脾肾，津液失运而停滞，日久而化痰。因此在冠心病形成之初，因更重视“痰”的地位，方可不错失治疗之良机。而在心系病变中，现今痰证常多合并热证而发，此与现代生活节奏快，精神紧张，或饮食结构改变，欲念繁杂而导致的心火上延，胃火亢盛，相火旺动有关。而冠心病的整个疾病阶段都与“瘀”紧密联系，血瘀即血液在经脉中运行不畅，或脱离或停止，不能及时消散，瘀积于脏腑经脉器官之中，久而凝滞，故为血瘀。而从冠脉临界病变血瘀证的RNA层面展开研究，可对寻找冠脉临界病生物标志物，对冠脉临界病变的诊断与新药研究都有十分重要的意义。
目的:
利用高通量测序法对冠心病冠脉临界病变患者，正常人，以及冠脉临界病变痰瘀热型患者，冠脉临界病变非痰淤热型患者进行全转录组测序，以期寻找其各组间的差异CircRNA表达，归纳其差异表达谱，对诊断生物标志物提供线索。并对其差异的母源基因进行GO富集分析与KEGG通路富集分析，利用生物学信息分析，展示其显著调控通路与生物学功能，探寻潜在的冠脉临界病变患者调控通路，为其未来临床诊断与新药研发提供方向与思路。
方法:
临床严格按照纳排标准共招募健康组患者5例，冠脉临界病变患者100例，从中选取15例，分为药物研究组5例，药物对照组5例，冠脉临界痰瘀热型5例，冠脉临界病变非痰瘀热型5例，健康组5例。对于药物临床观察组患者进行为期6个月的清热活血化痰方或清热活血化痰方模拟剂干预，完成一般临床资料统计与血液标本的采集工作。
对其期外周血白细胞进行分离纯化后，采用高通量测序法对其总RNA进行提取与鉴定，分析其表达差异的CircRNA，并绘制火山图，在对其进行聚类分析。将全部CircRNA母源基因作为背景列表，差异CircRNA母源基因列表作为从背景列表中筛选出来的候选列表，利用超几何分布检验计算代表GO功能集在差异CircRNA母源基因列表中是否显著富集，并对其使用GO富集分析top30，并绘制条形图示意图。
利用KEGG数据库对差异蛋白编码CircRNA进行Pathway分析(结合KEGG注释结果)，并用超几何分布检验的方法计算每个Pathway条目中差异CircRNA富集的显著性。对EGG富集分析top20(筛选对应差异CircRNA数目大于2的Pathway条目，按照每个条目对应的-log10pValue由大到小排序)的条目绘制气泡图。
结果:
1痰瘀热组与非痰瘀热组
冠脉临界痰瘀热型与非痰瘀热型患者中69个CircRNA的表达差异有统计学意义，其中36个CircRNA上调如CircRNA_01229、CircRNA_01400等。33个CircRNA下调如CircRNA_00462、CircRNA_00793等。聚类分析结果显示，两组各自聚集，可较好区分。
根据生物学分析结果可见，冠脉临界病变痰瘀热型患者差异表达的CircRNA主要参与DNA，RNA的合成与转录，蛋白质泛素化降解过程，其参与的细胞组成过程集中于细胞核与细胞膜的组成。而根据KEGG富集分析结果可见，其主要影响的信号通路为同源重组修复通路(Homologous recombination)
2冠脉临界病变患者与健康人组
通过对冠脉病变患者与健康人组的对比，发现中132个CircRNA的表达差异有统计学意义，其中43个CircRNA上调(circRNA_00071，circRNA_00797，circRNA_01109等)，89个CircRNA下调(circRNA_00162、circRNA_00216等)。聚类分析结果显示，两组各自聚集，可较好区分。说明在CircRNA在健康人与冠脉临界病变患者的基因调控中有着明显的差异，这些差异CircRNA可作为冠脉临界病变的生物标志物而进行下一步研究，冠脉临界病变作为一项较难准确定性其程度与斑块位置的疾病，其差异表达CircRNA的发现可为未来诊断提供新的思路。
与健康人相比，冠脉临界病变患者差异表达的CircRNA的母源基因上调所参与的过程主要在树突状细胞的分化与干扰素介导通路以及T细胞增殖的正向调控，其主要组成部分为内质网膜管腔侧，下调的基因主要参与脂肪细胞分化，WNT信号通路等，组成细胞液相关部分。而根据KEGG富集分析结果，发现自身免疫性甲状腺疾病与Ⅰ型糖尿病信号通路被显著富集。
3治疗组治疗前后对比
对比治疗组治疗前后血浆CircRNA发现，其中有71个CircRNA的表达差异有统计学意义，其中上调表达的37个(CircRNA_01102、CircRNA_01717、CircRNA_02870等)，下调34个(CircRNA_00718、CircRNA_01604、CircRNA_01626等)。聚类分析结果显示，两组各自聚集，可较好区分。说明在中药干预下，患者除临床表现体征有好转以外，患者在基因层面也有着明显的改变，且具有统计学意义，筛选出的差异CircRNA及其靶基因可作为中药治疗冠脉临界病变的靶点与生物标志物，且进一步验证了中医药治疗冠脉临界病变的临床效果。
对治疗组治疗半年前后的血浆CircRNA的母源基因进行GO富集分析和KEGG富集分析，发现其GO富集分析结果主要富集在DNA，RNA的转录过程与细胞核的组成。可见清热活血化痰方治疗前后主要改变的信号通路富集在粘附斑激酶相关信号通路。
4治疗组与对照组干预后对比
本还通过筛选对照组治疗后与研究组治疗后的差异表达CircRNA差异来验证清热活血化痰方的治疗效果，研究结果显示，与安慰剂组相比，共有78个CircRNA的表达差异有统计学意义，其中上调表达的33个(CircRNA_00023、Cir cRNA_01578、CircRNA_01639)，下调45个。聚类分析结果显示，两组各自聚集，可较好区分。说明与在常规西药干预下安慰剂组相比，中药的联合应用能起到更好的治疗效果。
结论:
冠脉临界病变患者痰瘀热型与非痰瘀热型在CircRNA_01229、CircRNA_01400等69个CircRNA有表达差异，且差异具有统计学意义。
在高通量测序技术检测下发现，与正常人相比，冠脉临界病变患者的circRNA_00071，circRNA_00797，circRNA_00162、circRNA_00216等132个CircRNA有表达差异，且差异具有统计学意义。
清热活血化痰方干预前后，冠脉临界病变患者的CircRNA_01102、CircRNA_01717、CircRNA_02870、CircRNA_00718、CircRNA_01604、CircRNA_01626等71个CircRNA有表达差异，且差异具有统计学意义。
同时使用清热活血化痰方与安慰剂组分别干预，两组干预后的血清CircRNA共有78个表达差异，且差异具有统计学意义。
近年来，随着健康知识宣教与普及，越来越多的年轻群体已经开始注意心脏系统的保护与疾病预防，冠脉临界病变作为冠心病的初始阶段，日益受到人们的关注。冠心病冠脉临界病变是指行冠状动脉造影后，其狭窄程度在30-70%的病变。冠脉临界病变是冠心病的发展的初始阶段，该阶段中患者体征较不明显或无体征，一般认为在冠状动脉狭窄程度小于70%的状态下，多对患者采取药物干预为主，而中医药的干预十分有意义。
冠心病冠脉临界病变的中医证候分析可认为跟“痰”“热”“瘀”有关，现代人滋食肥甘厚腻之品，又缺乏适当运动，脾胃不运则水谷积聚，而生污浊之痰；加以空气污浊，雾霾颗粒密度较高，而又吸食烟草，病邪从肺而入，伤及肺脾肾，津液失运而停滞，日久而化痰。因此在冠心病形成之初，因更重视“痰”的地位，方可不错失治疗之良机。而在心系病变中，现今痰证常多合并热证而发，此与现代生活节奏快，精神紧张，或饮食结构改变，欲念繁杂而导致的心火上延，胃火亢盛，相火旺动有关。而冠心病的整个疾病阶段都与“瘀”紧密联系，血瘀即血液在经脉中运行不畅，或脱离或停止，不能及时消散，瘀积于脏腑经脉器官之中，久而凝滞，故为血瘀。而从冠脉临界病变血瘀证的RNA层面展开研究，可对寻找冠脉临界病生物标志物，对冠脉临界病变的诊断与新药研究都有十分重要的意义。
目的:
利用高通量测序法对冠心病冠脉临界病变患者，正常人，以及冠脉临界病变痰瘀热型患者，冠脉临界病变非痰淤热型患者进行全转录组测序，以期寻找其各组间的差异CircRNA表达，归纳其差异表达谱，对诊断生物标志物提供线索。并对其差异的母源基因进行GO富集分析与KEGG通路富集分析，利用生物学信息分析，展示其显著调控通路与生物学功能，探寻潜在的冠脉临界病变患者调控通路，为其未来临床诊断与新药研发提供方向与思路。
方法:
临床严格按照纳排标准共招募健康组患者5例，冠脉临界病变患者100例，从中选取15例，分为药物研究组5例，药物对照组5例，冠脉临界痰瘀热型5例，冠脉临界病变非痰瘀热型5例，健康组5例。对于药物临床观察组患者进行为期6个月的清热活血化痰方或清热活血化痰方模拟剂干预，完成一般临床资料统计与血液标本的采集工作。
对其期外周血白细胞进行分离纯化后，采用高通量测序法对其总RNA进行提取与鉴定，分析其表达差异的CircRNA，并绘制火山图，在对其进行聚类分析。将全部CircRNA母源基因作为背景列表，差异CircRNA母源基因列表作为从背景列表中筛选出来的候选列表，利用超几何分布检验计算代表GO功能集在差异CircRNA母源基因列表中是否显著富集，并对其使用GO富集分析top30，并绘制条形图示意图。
利用KEGG数据库对差异蛋白编码CircRNA进行Pathway分析(结合KEGG注释结果)，并用超几何分布检验的方法计算每个Pathway条目中差异CircRNA富集的显著性。对EGG富集分析top20(筛选对应差异CircRNA数目大于2的Pathway条目，按照每个条目对应的-log10pValue由大到小排序)的条目绘制气泡图。
结果:
1痰瘀热组与非痰瘀热组
冠脉临界痰瘀热型与非痰瘀热型患者中69个CircRNA的表达差异有统计学意义，其中36个CircRNA上调如CircRNA_01229、CircRNA_01400等。33个CircRNA下调如CircRNA_00462、CircRNA_00793等。聚类分析结果显示，两组各自聚集，可较好区分。
根据生物学分析结果可见，冠脉临界病变痰瘀热型患者差异表达的CircRNA主要参与DNA，RNA的合成与转录，蛋白质泛素化降解过程，其参与的细胞组成过程集中于细胞核与细胞膜的组成。而根据KEGG富集分析结果可见，其主要影响的信号通路为同源重组修复通路(Homologous recombination)
2冠脉临界病变患者与健康人组
通过对冠脉病变患者与健康人组的对比，发现中132个CircRNA的表达差异有统计学意义，其中43个CircRNA上调(circRNA_00071，circRNA_00797，circRNA_01109等)，89个CircRNA下调(circRNA_00162、circRNA_00216等)。聚类分析结果显示，两组各自聚集，可较好区分。说明在CircRNA在健康人与冠脉临界病变患者的基因调控中有着明显的差异，这些差异CircRNA可作为冠脉临界病变的生物标志物而进行下一步研究，冠脉临界病变作为一项较难准确定性其程度与斑块位置的疾病，其差异表达CircRNA的发现可为未来诊断提供新的思路。
与健康人相比，冠脉临界病变患者差异表达的CircRNA的母源基因上调所参与的过程主要在树突状细胞的分化与干扰素介导通路以及T细胞增殖的正向调控，其主要组成部分为内质网膜管腔侧，下调的基因主要参与脂肪细胞分化，WNT信号通路等，组成细胞液相关部分。而根据KEGG富集分析结果，发现自身免疫性甲状腺疾病与Ⅰ型糖尿病信号通路被显著富集。
3治疗组治疗前后对比
对比治疗组治疗前后血浆CircRNA发现，其中有71个CircRNA的表达差异有统计学意义，其中上调表达的37个(CircRNA_01102、CircRNA_01717、CircRNA_02870等)，下调34个(CircRNA_00718、CircRNA_01604、CircRNA_01626等)。聚类分析结果显示，两组各自聚集，可较好区分。说明在中药干预下，患者除临床表现体征有好转以外，患者在基因层面也有着明显的改变，且具有统计学意义，筛选出的差异CircRNA及其靶基因可作为中药治疗冠脉临界病变的靶点与生物标志物，且进一步验证了中医药治疗冠脉临界病变的临床效果。
对治疗组治疗半年前后的血浆CircRNA的母源基因进行GO富集分析和KEGG富集分析，发现其GO富集分析结果主要富集在DNA，RNA的转录过程与细胞核的组成。可见清热活血化痰方治疗前后主要改变的信号通路富集在粘附斑激酶相关信号通路。
4治疗组与对照组干预后对比
本还通过筛选对照组治疗后与研究组治疗后的差异表达CircRNA差异来验证清热活血化痰方的治疗效果，研究结果显示，与安慰剂组相比，共有78个CircRNA的表达差异有统计学意义，其中上调表达的33个(CircRNA_00023、Cir cRNA_01578、CircRNA_01639)，下调45个。聚类分析结果显示，两组各自聚集，可较好区分。说明与在常规西药干预下安慰剂组相比，中药的联合应用能起到更好的治疗效果。
结论:
冠脉临界病变患者痰瘀热型与非痰瘀热型在CircRNA_01229、CircRNA_01400等69个CircRNA有表达差异，且差异具有统计学意义。
在高通量测序技术检测下发现，与正常人相比，冠脉临界病变患者的circRNA_00071，circRNA_00797，circRNA_00162、circRNA_00216等132个CircRNA有表达差异，且差异具有统计学意义。
清热活血化痰方干预前后，冠脉临界病变患者的CircRNA_01102、CircRNA_01717、CircRNA_02870、CircRNA_00718、CircRNA_01604、CircRNA_01626等71个CircRNA有表达差异，且差异具有统计学意义。
同时使用清热活血化痰方与安慰剂组分别干预，两组干预后的血清CircRNA共有78个表达差异，且差异具有统计学意义。