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目的:通过尿毒灵及其有效成分宝藿苷-Ⅰ、人参皂苷Rd对肾小管上皮细胞（HK-2）TGF-β 1/Smads信号通路的调控以及对HK-2细胞形态、生长周期和迁移能力的影响,探讨尿毒灵及其有效成分治疗肾纤维化、糖尿病肾病的作用机制。方法:1.细胞模型的建立:采用2ng/mL TGF-β1诱导HK-2细胞;按给药时间不同分为Gr-A、Gr-B、Gr-C、Gr-D 四种:Gr-A 为先给药 24h 再加 2ng/mL TGF-β1 作用 30min;Gr-B为先给药24h再加2ng/mL TGF-β 1作用24h;Gr-C为实验药物和2ng/mL TGF-β1同时加入30min后观察各指标;Gr-D为实验药物和2ng/mL TGF-β1同时加入24h后观察各指标;每个实验组的药物均为尿毒灵、人参皂苷Rd、宝藿苷-Ⅰ。2.人参皂苷Rd、宝藿苷-Ⅰ的浓度筛选:采用MTT法测定两种单体对HK-2细胞增殖的影响。3.HK-2细胞迁移能力改变:采用划痕实验,测定Gr-B中药物对HK-2细胞迁移能力的影响。4.HK-2细胞形态学及生长周期的研究:用全自动倒置显微镜观察细胞形态的改变及流式细胞术观察细胞处理前后生长周期的改变。5.HK-2细胞基因表达的测定:采用PCR技术测定Gr-A、Gr-B两种方式中Smad2、Smad3、Smad4、Smad7及Smurf2的基因表达情况。6.HK-2细胞蛋白表达的测定:采用Western blot实验检测Gr-A、Gr-C两种方式中,Smad4蛋白表达、Smad2、Smad3蛋白表达及磷酸化情况和Gr-B、Gr-D两种方式中,Smad7蛋白的表达。结果:1.通过MTT实验,确定药物的安全浓度范围,根据参考文献和MTT实验结果最终确定三种药物的工作浓度分别为:宝藿苷-Ⅰ:1 μ g/mL、5 μg/mL、25 μ g/mL;人参皂苷 Rd:50μg/mL、100 μ g/mL;尿毒灵:100μg/mL、500 μ g/mL、1000 μg/mL。2.HK-2细胞形态学改变:空白组细胞贴壁生长,细胞成椭圆形,即“铺路石”样形态。Gr-A组中,与空白组相比,模型组细胞仍为铺路石样;Gr-B组中,模型组细胞变长,表现为成纤维细胞样形态,宝藿苷-Ⅰ组和尿毒灵组细胞形态纤维样减轻并逐渐接近正常细胞,人参皂苷Rd的作用不明显。3.迁移实验结果表明,Gr-B:与空白组相比,模型组细胞融合程度显著增大,宝藿苷-Ⅰ中剂量组、50 μ g/mL人参皂苷Rd、尿毒灵中高剂量组融合程度明显减小。4.HK-2细胞周期结果显示,Gr-A:与空白组相比,模型组及各给药组对HK-2细胞周期影响不大;Gr-B:与空白组相比,模型组G2/M期细胞数目明显下降（P<0.05）,各给药组均有显著上调作用;S期:模型组细胞数目下降,宝藿苷-1、人参皂苷Rd未起到上调作用,尿毒灵高剂量组能显著改善这一趋势（P<0.05）,因此,在药物的作用上,复方尿毒灵对细胞周期影响最大。5.HK-2细胞基因表达结果显示,Gr-A:与空白组相比,模型组Smad2、Smad3、Smad4、Smad7及Smurf2的基因表达结果差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比,Smad2、Smad3、Smad4,各给药组无明显作用;Smad7:宝藿苷-1、人参皂苷Rd、尿毒灵均可促进其基因表达,其中,宝藿苷-Ⅰ高剂量组、人参皂苷Rd高剂量组则显著上调其基因表达（P<0.05）;尿毒灵各浓度对其表达的促进作用均十分明显（P<0.01）;Smurf2:人参皂苷Rd高剂量组可显著上调其表达（P<0.01）,而尿毒灵则有降低其表达的趋势,但差异无统计学意义。Gr-B:与空白组相比,模型组Smad2、Smad4的基因表达无明显变化;Smad3的基因表达显著下降（P<0.001）;Smad7、Smurf2的基因表达显著上升（P<0.05）;与模型组相比:Smad2、Smad3、Smad4、Smurf2:各给药组作用不明显。6.Western blot 法测得,Gr-C:与空白组相比,模型组 p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3:明显上调（P<0.05、P<0.05、P<0.01、P<0.05）。与模型组相比,尿毒灵组中高剂量可显著降低p-Smad2、p-Smad3、Smad3蛋白表达（P<0.05）,且具有剂量依赖性;另外,尿毒灵低剂量组可显著下调Smad2蛋白表达（P<0.05）;宝藿苷-Ⅰ和人参皂苷Rd对这几个蛋白的表达没有明显作用。Gr-A:与空白组相比:模型组p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3蛋白表达量显著增加（P<0.05、P<0.05、P<0.01、P<0.05）;Smad4:有上调趋势,但差异无统计学意义。与模型组相比:p-Smad2:宝藿苷-Ⅰ对其作用不明显、人参皂苷Rd对其显著下调,差异有统计学意义（P<0.05）,尿毒灵有剂量依赖性下调作用,高剂量组差异有统计学意义（P<0.05）;p-Smad3、Smad3、Smad4:宝藿苷-Ⅰ、人参皂苷Rd基本无作用;尿毒灵高剂量组均有下调作用,差异有统计学意义（P<0.05）。Gr-B、Gr-D:与空白组相比,模型组Smad7蛋白表达稍有上升,但差异无统计学意义,而各给药组也基本无作用。结论:1.采用2ng/mLTGF-β1诱导HK-2细胞24h,使HK-2细胞形态由铺路石样转变为成纤维细胞样,细胞迁移能力增强;各给药组可不同程度的减轻细胞形态的改变,抑制TGF-β 1诱导的HK-2细胞的迁移,对肾脏有一定的保护作用。2.宝藿苷-Ⅰ、人参皂苷Rd、尿毒灵组均使HK-2细胞的G2/M期细胞增多;尿毒灵能显著上调S期的细胞数量,表明尿毒灵对HK-2细胞周期的影响相对宝藿苷-Ⅰ、人参皂苷Rd大。3.以Gr-A方式,模型组各指标蛋白的基因表达无明显差异,但对应的蛋白都显著增加,即Smad2、Smad3明显被活化,Smad2、Smad3的磷酸化水平升高,Smads信号通路被启动,且Smad3的蛋白表达也大幅提高;此过程中,HK-2细胞的形态、生长周期、及基因表达未受到影响。而给药组对HK-2细胞的基因和蛋白表达产生了一定的影响,尿毒灵比宝藿苷-Ⅰ和人参皂苷Rd作用明显。4.以Gr-B方式:模型组中Smad3基因表达显著下调,Smad7、Smurf2的基因表达均显著上升,此时HK-2细胞的生长周期和细胞形态均发生了变化,细胞的迁移能力增强。5.无论是先给药后造模还是同时给药造模30min,模型组细胞中p-Smad2、p-Smad3、Smad3蛋白的表达均显著增加,说明,TGF-β 1就已激活了 TGF-β 1/Smads信号通路;尿毒灵对其有明显的抑制作用,显著下调p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3蛋白的表达。人参皂苷Rd高剂量仅能显著下调p-Smad2蛋白的表达。总体而言,尿毒灵可以抑制Smad2、Smad3的蛋白表达,而且抑制它们的磷酸化,从而抑制肾纤维化进程,宝藿苷-Ⅰ和人参皂苷Rd的作用没有尿毒灵效果好。6.综上所述,尿毒灵及其有效成分可调控TGF-β 1/Smads信号通路,起到治疗肾纤维化的作用。