细菌感染严重威胁着人类的健康与生存，其中临床病原菌的耐药问题尤为突出，给临床治疗感染性疾病带来严重困难，细菌耐药性的检测显得日趋重要，但是目前检测方法仍以传统表型方法为主。另一方面，感染性疾病的防控依赖于病原菌的溯源分析，分子分型是溯源分析的重要手段，而现有的分子分型方法在分辨力、重现性、简便性、通量和成本等方面仍然存在着各种问题和不足。本论文围绕病原菌的耐药性检测和分子分型展开研究，凭借实时PCR技术和探针熔解曲线分析技术，建立了一种病原菌耐药基因的快速检测系统和一种准确、简便的分子分型新技术，以更好地服务于临床诊断和分子流行病学研究。　　绪论部分首先简要介绍了细菌感染和各种诊断方法，包括常规药敏试验、分子药敏试验和现有的分子分型技术，然后总结了实时PCR技术和探针熔解曲线分析技术的原理和特点，最后提出本论文的研究目的、内容及意义。　　第一部分针对临床β-内酰胺酶检测的滞后性与局限性，利用实时PCR技术和探针熔解曲线分析技术的多种优势，探索在临床实验室建立一种对β-内酰胺酶耐药基因的快速检测系统，具体研究内容包括两章。　　第一章以ampC耐药基因为研究对象，将多重PCR技术与探针熔解曲线分析技术相结合，建立了一种多重实时PCR-MCA方法，在单个反应中即可完成ampC六群基因的检测和分型，并可通过测序确定基因型。该体系以细菌的16SrDNA为内控，共包含7对引物和7条探针，整个检测过程在2h内由仪器自动完成。利用176株头孢西丁耐药的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对体系进行评价，共检出ampC基因阳性菌株36株，阳性率为20.5％。其中19株为DHA阳性、6株为EBC阳性、12株为CIT阳性，与测序结果完全相符，基因型包括DHA-1、DHA-5、Mir-3、ACT-15、ACT-16、CMY-2、CMY-4和CMY-42。在36株阳性菌株中，检出1株肺炎克雷伯菌同时含有2种质粒ampC基因（DHA-1+Mir-3），这在国内外属于首次。将上述检测结果与现今作为“金标准”的多重普通PCR方法的检测结果对比，发现多重普通PCR方法对EBC群质粒ampC基因存在漏检现象，两种方法的一致率为97.7％。最后我们用多重实时PCR-MCA方法对429株随机选取的革兰阴性临床分离株进行检测，检出ampC基因阳性菌株34株，阳性率为7.9％。多重实时PCR-MCA方法的检测能力涵盖了目前已发现的140多种ampC基因型，且具有灵敏度高、特异性好、准确性高、简便快速等优点，如果应用于临床可以大大减少误用的抗生素处方率，帮助医生选用针对性更强的抗生素，缩短疗程，减轻细菌耐药性产生和扩散的选择压力，延缓耐药菌株的出现。　　第二章以6种获得性MBL耐药基因为研究对象，利用多个荧光标记的探针，分别建立了2种探针熔解体系和1种实时PCR扩增体系，经过各方面考察最终选用实时PCR扩增体系，该体系对6种MBL基因的检测灵敏度可达5或50拷贝/反应。利用429株随机选取的革兰阴性临床分离株对实时PCR体系进行初步评价，共检出MBL基因阳性菌株6株，与测序结果完全一致，其中2株铜绿假单胞菌含有IMP-9，2株铜绿假单胞菌同时含有VIM-2和SIM-1，1株鲍曼不动杆菌含有IMP-8，1株恶臭假单胞菌同时含有IMP-8和VIM-1，SIM-1基因型的检出在国内属于首次。该方法可以检测目前已发现的80多种MBL基因型，且在特异性、灵敏度、准确性、简便性等方面具有明显优势，可以对院内感染病原菌的耐药性从基因型水平上进行监测，为临床合理使用抗菌药物、医院感染控制及耐药机制研究提供依据。　　第二部分以霍乱弧菌为模型，建立了一种新型的病原分型技术——基于探针熔解曲线分析的多位点熔解分型技术(McMLMT)。首先参照MLST原理，筛选出7个管家基因。针对每个管家基因，进行引物和探针设计，并通过软件预测和预杂交实验，确定“一基因四探针、双管双色”的分型方案。以实时PCR为平台，对每一菌株可获得28维熔点特征值组成的熔点图谱。利用108株O1群霍乱弧菌对体系进行初步评价，McMLMT将108株菌分为18种型别，与MLST的分型结果相同，两种方法的D值均为0.7233，二者表现出相同的区分能力。对其中的46株菌，PFGE分为11种带型，McMLMT分为13种型别。与当前的病原分型技术相比，McMLMT在分辨力、重复性、操作简便性、通量和成本等方面具有明显优势，在临床实验室和微生物分型领域有较大的应用前景。