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大段骨缺损导致骨组织失去连续性，机体难以自身修复，对机体健康造成了严重的危害。目前骨缺损的治疗方法主要有骨相关材料填充治疗、手术治疗(如骨搬运技术)等治疗方式。其中骨材料填充方法包括自体骨移植、异体骨移植和人工材料移植等。我们在运用自体骨、同种异体骨、异种异体骨治疗时，常常遇到骨吸收、骨不愈合、感染等问题。有学者利用骨组织工程技术来治疗骨缺损。然而，大量研究发现骨缺损的修复早期，由于新生血管未建立，缺损处氧分压极低，对骨缺损的修复非常不利。近年来，有多种携氧和释氧材料被应用于缺氧基础研究，其中全氟三丁胺(Perfluorotributylamine，PFTBA)因其良好的氧溶解性和无毒性，大量研究采用其来解决组织缺氧的问题。综上所述，本实验通过构建复合有携氧材料PFTBA的藻酸盐/生物玻璃的骨组织工程材料，并将ADSCs种植此材料中，通过体外实验中探索含有不同浓度PFTBA的藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料对缺氧状态下脂肪干细胞增殖、黏附及成骨分化的影响，并进行体内实验验证。整个研究分为以下三个部分：
第一部分：PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料的制备及理化性质的检测
背景：种子细胞在移植早期，由于骨缺损造成的低氧环境而难以存活，导致骨组织工程材料对骨缺损的修复达不到效果。PFTBA作为一种很好的携氧材料，在本实验中，我们将其与藻酸盐及生物玻璃混合，制作出PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料，以骨组织工程支架自身释放足够的氧气为种子细胞供氧的方式来解决上述问题。
目的：构建PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料，并检测其释氧能力和理化性质。
方法：制备含有不同浓度(0%，5%，10%，20%)的PFTBA的藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料。使用血气分析仪评估复合PFTBA的藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料在缺氧条件下对周围环境的释氧能力。用BoseElectroForce3220动磁式材料测试机检测各组材料的压缩模量。应用接触角测量仪测量各组材料的亲水性。
结果：在缺氧培养下，复合有PFTBA的材料组(5%，10%，20%PFTBA组)在缺氧培养72h内材料周围培养基氧分压明显优于缺氧组(0%PFTBA组)，同时，含有10%浓度的PFTBA与20%浓度的PFTBA的藻酸盐/生物玻璃材料的培养基氧分压在不同时间点明显高于含有5%浓度的PFTBA的材料组，并且二者在释氧能力上无明显差异。通过压缩模量的测量可以发现，含有生物玻璃组别的材料较单纯海藻酸盐凝胶的压缩模量高。亲水性测试发现，加入PFTBA后，材料的亲水性会下降。
结论：通过本实验方法制作PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料，该材料在缺氧环境下具有供氧能力，并具有一定的机械性能和亲水性。
第二部分：缺氧条件下PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料对ADSCs活性及成骨分化影响的体外研究
背景：随着骨组织工程技术的发展，研究者们发现，在应用骨组织工程技术解决骨缺损的问题时，骨缺损部位的氧分压下降影响骨折自身的修复过程，同时也会对骨组织工程材料移植后的功能产生影响。因此需要构建一种具有自身供氧能力的工程材料，解决骨组织工程材料内部缺氧问题。同时，研究也发现不同细胞在体内的需氧条件是不同的。因此在构建组织工程材料时要考虑种子细胞的选择。本实验中，我们将ADSCs复合PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料，观察材料对ADSCs的增殖、黏附及成骨分化的影响。
目的：检测PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料对ADSCs的增殖、黏附及成骨能力的影响。
方法：将兔ADSCs细胞种植于含有不同浓度(0%，5%，10%，20%)PFTBA的藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料，通过CCK-8实验评价不同PFTBA浓度的材料组及空白对照组的细胞毒性；在缺氧及常氧培养条件下，通过CCK8法检测各组材料上细胞增殖情况，通过免疫荧光染色及扫描电镜检测细胞在四组材料的黏附能力。采用Live/Dead实验检测ADSCs在3D培养中材料内部的生存情况，统计其存活细胞率。通过ALP活性检测试剂盒测定材料上细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性，运用RT-PCR法测定细胞COL1A1、RUNX-2、OPN等成骨相关基因表达量，以此评价支架诱导细胞定向成骨分化能力。
结果：材料浸提液毒性测定结果显示四组材料细胞毒性与正常培养基的细胞毒性比较无显著意义。CCK-8检测ADSCs的增殖能力结果显示，缺氧条件下，含有PFTBA各组吸光度值显著高于不含PFTBA组。其中10%PFTBA材料组与20%PFTBA材料组的CCK-8吸光度值高于5%PFTBA材料组吸光度值(p＜0.05)，且10%PFTBA材料组与20%PFTBA材料组的CCK-8吸光度值无统计学差异(p＞0.05)。细胞黏附实验扫描电镜结果显示常氧10%PFTBA材料组、常氧对照组及缺氧10%PFTBA材料组较缺氧对照组细胞黏附状态良好。在缺氧条件下，缺氧10%PFTBA组黏附斑吸光度值显著高于缺氧对照组(P＜0.05)。3D培养下Live/Dead荧光实验结果显示，缺氧10%PFTBA组较缺氧组活细胞率高(P＜0.05)。ALP活性测定结果显示，缺氧条件下，缺氧10%PFTBA组细胞碱性磷酸酶活性显著高于缺氧对照组(P＜0.05)。RT-PCR检测OPN，RUNX2，COL1A1的基因转录水平，缺氧条件下，缺氧10%PFTBA组RUNX2、COL1A1基因表达量显著高于缺氧对照组(P＜0.05)，两组OPN基因表达量比较差异无显著性意义(p＞0.05)。
结论：缺氧条件下，含有10%浓度PFTBA材料能促进ADSCs的增殖、黏附及成骨分化能力。
第三部分：复合ADSCs的PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料对新西兰兔颅骨缺损修复体内研究
背景：在临床工作中，我们发现多种因素可以导致骨缺损的发生。自体骨移植，异体骨移植等方法应用为骨缺损的修复提供良好的解决方法。但由于骨的来源、免疫排斥、生物相容性的等问题限制了这些方法的应用。组织工程材料的应用很好的解决了这一问题。但许多研究发现骨缺损的低氧分压不利于骨组织工程材料功能的发挥。本研究证实复合ADSCs的PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料在体外能够促进成骨分化，但体内实验是否有同样的结果尚未得到证实。
目的：研究复合ADSCs的PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料在兔颅骨缺损体内的修复作用。
方法：将复合ADSCs的材料植入兔颅骨缺损模型(缺损直径为5mm)。于8、12周取材，通过Micro-CT扫描三维重建观察新生骨的生成情况，采用Van-Gieson染色观察四组材料促进体内成骨的作用。
结果：Micro-CT三维重建结果显示：在动物实验后8周及12周后取材，PFTBA/藻酸盐/生物玻璃组材料组新骨生成所占体积百分比最高，骨小梁厚度、数量最高，分离度最低(P＜0.05)。Van-Gieson染色结果发现8周时，PFTBA/藻酸盐/生物玻璃组材料新生骨组织更多；12周时，在PFTBA/藻酸盐/生物玻璃组材料周围可见到骨板、海绵状骨和新生骨痂形成。
结论：复合ADSCs的PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料对兔颅骨缺损有一定的修复作用。
第一部分：PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料的制备及理化性质的检测
背景：种子细胞在移植早期，由于骨缺损造成的低氧环境而难以存活，导致骨组织工程材料对骨缺损的修复达不到效果。PFTBA作为一种很好的携氧材料，在本实验中，我们将其与藻酸盐及生物玻璃混合，制作出PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料，以骨组织工程支架自身释放足够的氧气为种子细胞供氧的方式来解决上述问题。
目的：构建PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料，并检测其释氧能力和理化性质。
方法：制备含有不同浓度(0%，5%，10%，20%)的PFTBA的藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料。使用血气分析仪评估复合PFTBA的藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料在缺氧条件下对周围环境的释氧能力。用BoseElectroForce3220动磁式材料测试机检测各组材料的压缩模量。应用接触角测量仪测量各组材料的亲水性。
结果：在缺氧培养下，复合有PFTBA的材料组(5%，10%，20%PFTBA组)在缺氧培养72h内材料周围培养基氧分压明显优于缺氧组(0%PFTBA组)，同时，含有10%浓度的PFTBA与20%浓度的PFTBA的藻酸盐/生物玻璃材料的培养基氧分压在不同时间点明显高于含有5%浓度的PFTBA的材料组，并且二者在释氧能力上无明显差异。通过压缩模量的测量可以发现，含有生物玻璃组别的材料较单纯海藻酸盐凝胶的压缩模量高。亲水性测试发现，加入PFTBA后，材料的亲水性会下降。
结论：通过本实验方法制作PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料，该材料在缺氧环境下具有供氧能力，并具有一定的机械性能和亲水性。
第二部分：缺氧条件下PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料对ADSCs活性及成骨分化影响的体外研究
背景：随着骨组织工程技术的发展，研究者们发现，在应用骨组织工程技术解决骨缺损的问题时，骨缺损部位的氧分压下降影响骨折自身的修复过程，同时也会对骨组织工程材料移植后的功能产生影响。因此需要构建一种具有自身供氧能力的工程材料，解决骨组织工程材料内部缺氧问题。同时，研究也发现不同细胞在体内的需氧条件是不同的。因此在构建组织工程材料时要考虑种子细胞的选择。本实验中，我们将ADSCs复合PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料，观察材料对ADSCs的增殖、黏附及成骨分化的影响。
目的：检测PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料对ADSCs的增殖、黏附及成骨能力的影响。
方法：将兔ADSCs细胞种植于含有不同浓度(0%，5%，10%，20%)PFTBA的藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料，通过CCK-8实验评价不同PFTBA浓度的材料组及空白对照组的细胞毒性；在缺氧及常氧培养条件下，通过CCK8法检测各组材料上细胞增殖情况，通过免疫荧光染色及扫描电镜检测细胞在四组材料的黏附能力。采用Live/Dead实验检测ADSCs在3D培养中材料内部的生存情况，统计其存活细胞率。通过ALP活性检测试剂盒测定材料上细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性，运用RT-PCR法测定细胞COL1A1、RUNX-2、OPN等成骨相关基因表达量，以此评价支架诱导细胞定向成骨分化能力。
结果：材料浸提液毒性测定结果显示四组材料细胞毒性与正常培养基的细胞毒性比较无显著意义。CCK-8检测ADSCs的增殖能力结果显示，缺氧条件下，含有PFTBA各组吸光度值显著高于不含PFTBA组。其中10%PFTBA材料组与20%PFTBA材料组的CCK-8吸光度值高于5%PFTBA材料组吸光度值(p＜0.05)，且10%PFTBA材料组与20%PFTBA材料组的CCK-8吸光度值无统计学差异(p＞0.05)。细胞黏附实验扫描电镜结果显示常氧10%PFTBA材料组、常氧对照组及缺氧10%PFTBA材料组较缺氧对照组细胞黏附状态良好。在缺氧条件下，缺氧10%PFTBA组黏附斑吸光度值显著高于缺氧对照组(P＜0.05)。3D培养下Live/Dead荧光实验结果显示，缺氧10%PFTBA组较缺氧组活细胞率高(P＜0.05)。ALP活性测定结果显示，缺氧条件下，缺氧10%PFTBA组细胞碱性磷酸酶活性显著高于缺氧对照组(P＜0.05)。RT-PCR检测OPN，RUNX2，COL1A1的基因转录水平，缺氧条件下，缺氧10%PFTBA组RUNX2、COL1A1基因表达量显著高于缺氧对照组(P＜0.05)，两组OPN基因表达量比较差异无显著性意义(p＞0.05)。
结论：缺氧条件下，含有10%浓度PFTBA材料能促进ADSCs的增殖、黏附及成骨分化能力。
第三部分：复合ADSCs的PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料对新西兰兔颅骨缺损修复体内研究
背景：在临床工作中，我们发现多种因素可以导致骨缺损的发生。自体骨移植，异体骨移植等方法应用为骨缺损的修复提供良好的解决方法。但由于骨的来源、免疫排斥、生物相容性的等问题限制了这些方法的应用。组织工程材料的应用很好的解决了这一问题。但许多研究发现骨缺损的低氧分压不利于骨组织工程材料功能的发挥。本研究证实复合ADSCs的PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料在体外能够促进成骨分化，但体内实验是否有同样的结果尚未得到证实。
目的：研究复合ADSCs的PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料在兔颅骨缺损体内的修复作用。
方法：将复合ADSCs的材料植入兔颅骨缺损模型(缺损直径为5mm)。于8、12周取材，通过Micro-CT扫描三维重建观察新生骨的生成情况，采用Van-Gieson染色观察四组材料促进体内成骨的作用。
结果：Micro-CT三维重建结果显示：在动物实验后8周及12周后取材，PFTBA/藻酸盐/生物玻璃组材料组新骨生成所占体积百分比最高，骨小梁厚度、数量最高，分离度最低(P＜0.05)。Van-Gieson染色结果发现8周时，PFTBA/藻酸盐/生物玻璃组材料新生骨组织更多；12周时，在PFTBA/藻酸盐/生物玻璃组材料周围可见到骨板、海绵状骨和新生骨痂形成。
结论：复合ADSCs的PFTBA/藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料对兔颅骨缺损有一定的修复作用。