本文主要应用了MMT法、流式细胞术、荧光定量PCR技术和Westernblot技术等，就Polη在HQ所致的跨损伤DNA合成过程中的作用及其机制进行初步的探讨。着重研究HQ所致的DNA损伤后L-02肝细胞内Polη基因及其酶表达的变化，探讨HQ与机体交互作用的规律，并提出DNA损伤应答的敏感性生物标志物，从而为建立HQ致机体损伤的预警体系提供相应的科学依据。 研究方法： 一、HQ对L-02肝细胞一般毒性的研究。 1.培养L-02肝细胞至对数生长期，首先用大范围剂量(0μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、1000μmol/L、10mmol/L和100mmol/L)的HQ分别染毒24h，MTT法检测细胞的存活率；接着用小范围剂量(0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L和320μmol/L)的HQ于不同时间(6h、12h、24h和48h)作用于L-02肝细胞，再利用MTT法检测细胞存活率，确定L-02肝细胞对HQ的剂量-反应关系和时间-反应关系。 2.利用万能倒置显微镜观察不同浓度HQ染毒24h后L-02肝细胞的形态学改变并拍照成像。 3.利用全自动生化分析仪检测不同浓度HQ染毒24h后L-02肝细胞的LDH漏出率、ALT和AST活性。 二、实时荧光定量PCR技术检测不同浓度HQ作用后L-02肝细胞内POLH及其相关因子在mRNA水平上的表达。 将L-02肝细胞用不同浓度HQ处理24h后，使用TRIzolreagent(Molecularresearchcenter公司)进行总RNA提取，用紫外分光光度计测定RNA纯度；并进行琼脂糖凝胶电泳以鉴定RNA的完整性；然后用RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit反转录试剂盒(Fermentas公司)按照厂家说明将RNA反转录成cDNA，所合成的cDNA应立即使用或置于-20℃保存。使用Brilliant(R)SYBR(R)GreenQPCRMasterMix试剂盒(Stratagene公司)在Mx4000荧光定量PCR仪(Stratagene公司)上进行实时荧光定量PCR，以检测各目的基因的mRNA水平。反应体系为：ddH2O10.5μl；cDNA1μl；2×SYBRGreenQPCRmastermix12.5μl；Forwardprimer(10μM)0.5μl；Reverseprimer(10μM)0.5μl；总体积为25μl。 三、使用Westernblot技术检测不同浓度HQ作用后L-02肝细胞内Polη及其相关因子在蛋白质水平上的表达。 各目的蛋白的表达通过Westernblot进行检测，将经HQ处理24b的L-02肝细胞用预冷过的PBS洗3次，之后加入单去污裂解液(50mMTris-HCl，PH8.0；150mMNaCl；100μg/mlPMSF；1％TritonX-100)，冰上裂解30min；12000g离心5min，去除细胞碎片；接着取40μg样品与上样缓冲液混和，煮沸4min，进行8％SDS-PAGE电泳，转PVDF膜。将膜置于SuperBlock(R)blockingBufferinTBS封闭液中(Pierce公司产品)中4℃条件下封闭过液。随后将膜置于用封闭液按1∶200稀释过的一抗(POLH鼠单克隆IgG1抗体、PCNA鼠单克隆IgG2a抗体、UBC2羊多克隆IgG抗体、Rad18羊多克隆IgG抗体和α-Tubulin鼠单克隆IgG抗体，SantaCruz公司)中孵育1h；TBST漂洗之后，将膜置于用封闭液按1∶2000稀释过的辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗鼠IgG抗体和驴抗羊IgG抗体，SantaCruz公司)中于室温下孵育1h；TBST漂沈3次之后，用ECL化学发光法检测。 四、使用流式细胞仪检测L-02肝细胞于HQ作用后的细胞凋亡及细胞周期分布。 五、统计学分析。 所有数据均以均值±标准差表示，使用SPSS11.0forwindows统计软件进行分析。 研究结果： 一、HQ对L-02肝细胞一般毒性的研究。 在相同的作用时间(6h、12h或24h)条件下，在0～320μmol/L范围内，L-02肝细胞的存活率随着HQ染毒剂量的增加而降低，其中160μmol/L和320μmol/L组与正常对照组比较有明显的差异(P＜0.01)；而在48h时间组内，HQ染毒剂量达到80μmol/L就可引起L-02肝细胞存活率的明显降低(P＜0.01)。在相同浓度(0～40μmol/L)的HQ作用下，随着HQ作用时间的延长，各剂量组细胞的存活率之间没有明显的差异(P＞0.05)；当HQ染毒时间超过48h时，80μmol/L、160μmol/L和320μmol/L的HQ染毒组L-02肝细胞的存活率与6h对照组比较有明显地减少(P＜0.01)。 HQ染毒24h之后，L-02肝细胞内的LDH漏出率、ALT和AST活性基本上具有随着HQ浓度的增加而升高的趋势；160μmol/L组和320μmol/L组L-02肝细胞内LDH漏出率与对照组比较有明显地升高(P＜0.01)。但ALT和AST活性只在320μmol/L组与对照组比较才有明显地增加(P＜0.01)。 此外，160μmol/L组和320μmol/L组L-02肝细胞的形态与对照组相比发生了明显的改变。 二、使用实时荧光定量PCR技术检测HQ作用后L-02肝细胞内Polη及其相关因子在mRNA水平上的表达。 在24h的时间范围内，POLH和PCNA基因在mRNA水平上的表达无论是染毒组(40μmol/L)还是未染毒组，均具有随时间的延长而增加的趋势；到24h时，相对表达量达到最大值，当培养时间达到48h时，该两个基因的表达则有所下降。RAD6和RAD18基因在未染毒组中的表达在48h范围内均有随时间的增加而升高的趋势，它们均在48h时间点上表达最高，其相对表达量分别为2.66和4.32；但在染毒组中，RAD6基因和RAD18基因在48h处的表达则有所下降，其相对表达量分别由3.74和4.83降至2.78和4.61。此外，在各时间处理组(6h、12h、24h和48h)中，染毒组L-02肝细胞内POLH、PCNA、RAD6和RAD18基因在mRNA水平上的表达均高于未染毒组。 各剂量HQ作用后，人L-02肝细胞内POLH基因mRNA的表达在0～80μmol/L范围内随着剂量的增加而增加，以对照组POLH基因的相对表达量为1，各染毒剂量组内POLH基因mRNA的相对表达量分别增至1.20、2.02、2.37、2.67、4.40和2.32倍；80μmol/L时其相对表达量达到峰值，160μmol/L的HQ作用后，其表达却有所下降，但仍高于对照组。PCNA基因mRNA的表达趋势与POLH基因的相似。而RAD6和RAD18基因的相对定量结果显示，在0～160μmol/L范围内，该两个基因在mRNA水平上的表达均随着染毒剂量的增加而升高；在160μmol/L处的表达均达到最高水平，其相对定量值分别为4.35和5.49。 三、使用Westernblot技术检测HQ作用后L-02肝细胞内Polη及其相关因子在蛋白质水平上的表达。 Westernblot检测结果显示，在0～80μmol/L的范围内，HQ可诱导Polη和Pcna蛋白表达的增加，其中在80μmol/L处表达量最高，当染毒剂量超过160μmol/L时，该两种蛋白的表达则有所下降。而Rad6的表达量则在0～160μmol/L范围内随着HQ剂量的增加而增加。在0～40μmol/L的范围内，HQ也可诱导Rad18表达的增加，其相对表达量依次为：0.16、0.18、0.20、0.37、0.42，而其在40μmol/L、80μmol/L和160μmol/L这三个剂量组间的表达有波动。 四、使用流式细胞仪检测L-02肝细胞于HQ作用后的细胞凋亡及细胞周期分布。 各剂量组(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L和320μmol/L)的HQ作用24h之后均可引起L-02肝细胞的调亡，并呈现出一定的剂量-反应关系；此外，还可出现明显的亚二倍体峰。0～80μmol/L范围内的HQ作用24h后，L-02肝细胞的细胞周期也发生了明显的改变，表现为S期细胞比例明显增加，G1期细胞的比例下降。 研究结论： 一、成功确定L-02肝细胞对HQ的剂量-反应关系及时间-反应关系，为进行下一步研究提供了依据。 二、在不引起细胞明显死亡的条件下，HQ可诱导跨损伤合成DNA聚合酶Polη在mRNA水平及蛋白质水平上表达的增加，并且呈现一定的剂量依赖性和时间依赖性。 三、从表达水平的角度上进一步证实，在L-02肝细胞内的DNA损伤耐受过程中，Polη可能与Pcna，Rad6和Rad18发生一定的时空联系，以共同完成跨损伤DNA合成过程。 四、HQ可诱导L-02肝细胞发生凋亡，并且在不引起细胞明显死亡的条件下，HQ可引起明显的S期细胞阻滞。Polη可能在受阻滞的S期内调节着细胞的生存和细胞调亡。