研究背景和目的：
　　缺血性中风后的神经元命运取决于复杂的生化和分子事件，包括兴奋性毒性，离子失衡，氧化应激，内质网应激，细胞凋亡和炎症。缺血相关转录组的快速改变影响这些事件的发生发展。尽管N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)在不同的生物过程中起着非常重要的作用，在所有器官中，大脑中RNA的m6A甲基化程度最高，但其在大脑中的功能仍未得到充分的探索。本课题重在进一步研究m6A修饰在脑缺血再灌注损伤中的作用以及其发挥效用的相关机制，旨在为脑缺血再灌注损伤的治疗提供新思路和新方法。
　　研究方法：
　　我们使用大鼠模型和原代神经元细胞培养来研究N6-甲基腺苷和Alkbh5/Fto在脑缺血再灌注损伤后大脑皮质缺血半暗带中的影响。选取SD大鼠作为实验对象，通过大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)构建大鼠脑缺血再灌注损伤模型。我们使用dot blot，免疫荧光来定性m6A在正常大鼠大脑皮层和缺血半暗带中的表达，通过Western blot和qRT-PCR法检测大脑皮层Alkbh5/Fto等相关作用蛋白的改变。选取大鼠第16-18天胚胎提取并进行培养的原代皮层神经元作为实验对象，通过糖氧剥夺/复氧(Glucose oxygen deprivation/reoxygenation，OGD/R)构建离体脑缺血再灌注损伤模型，从细胞层面验证m6A和其相关作用蛋白的改变。
　　我们使用Alkbh5-shRNA和Lv-Fto（体外）来调节Alkbh5/Fto的表达，以研究其对缺血再灌注损伤后大脑皮层中N6-甲基腺苷的调节及脑功能。选用大鼠原代皮层神经元作为实验对象，使用Alkbh5-shRNA和Lv-Fto慢病毒分别敲低Alkbh5蛋白和过表达Fto蛋白，并构建OGD/R模型。通过流式细胞术和细胞活性检测研究去甲基化酶Alkbh5/Fto在离体脑缺血再灌注模型中的效应。通过Western blot检测部分已知在脑缺血再灌注损伤中起重要作用的蛋白来探究Alkbh5/Fto介导脑缺血再灌注损伤过程的具体机制。此外，我们在离体脑缺血再灌注损伤模型中使用环亮氨酸(Cycloleucine，CL)或三甲基甘氨酸(Betaine)处理模拟去甲基化和甲基化过程，通过细胞活性检测和Hoechst33342/PI双染技术来检测细胞死亡情况，明确m6A在脑缺血再灌注损伤中的作用。
　　研究结果：
　　1、通过TTC染色明确大脑中动脉阻塞成功诱导了脑缺血再灌注损伤模型。选取造模后1天、3天、7天及14天的大脑皮层RNA做dot blot检测和造模后1天的大脑皮层做免疫荧光染色发现m6A修饰在造模后增加。通过MAP2检测神经元纯度，并建立离体脑缺血再灌注损伤模型，原代皮层神经元行dot blot检测和免疫荧光同样观察到m6A修饰在造模后增加。
　　2、大鼠MCAO处理的大脑皮层和OGD/R诱导的大鼠原代皮层神经元去甲基化酶Fto表达明显降低。此外，大鼠MCAO处理的大脑皮层和OGD/R诱导的大鼠原代皮层神经元去甲基化酶Alkbh5表达上升，然而，甲基化酶Mettl3和Mettl14等蛋白表达无明显改变。
　　3、在大鼠原代皮层神经元敲低Alkbh5并作OGD/R处理，使用流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示敲低Alkbh5进一步加重神经元凋亡，我们进一步通过细胞活性检测，同样发现敲低Alkbh5组细胞活性比对照组更低。此外，我们在大鼠原代皮层神经元过表达了Fto，流式细胞术和细胞活性检测都揭示在原代神经元过表达Fto缓解了OGD/R带来的细胞损伤。
　　4、在大鼠原代皮层神经元敲低Alkbh5，通过检测p-Akt，p-mTOR，Bcl2等蛋白，发现敲低Alkbh5明显降低Bcl2含量，类似的，我们在大鼠原代皮层神经元过表达Fto同样发现Bcl2表达上升，从而证明了去甲基化酶通过调控Bcl2进一步发挥在脑缺血再灌注损伤中的作用。
　　5、通过在大鼠原代皮层神经元给予三甲基甘氨酸或环亮氨酸处理模拟去甲基化和甲基化过程，细胞活性检测和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）染色结果表明甲基化加重了OGD/R诱导的细胞损伤，而去甲基化则缓解了OGD/R诱导的细胞死亡。
　　研究结论：
　　总的来说，我们的研究结果表明去甲基酶Alkbh5/Fto共同调节N6-甲基腺苷去甲基化，这在脑缺血再灌注损伤中起着至关重要的作用，其主要通过Bcl2蛋白作为效应蛋白参与了脑缺血再灌注损伤的病理生理过程。这个研究结果为中风的治疗机制提供了新颖的见解。