论文部分内容阅读
聚乳酸(PLA)作为最具应用潜力的生物可降解性塑料，市场潜力十分巨大。高旋光度D-型乳酸对提高聚乳酸料的耐热性起着至关重要的作用。微生物发酵是生产高光学纯度D-型乳酸的一条重要途径，但是目前缺乏进行低成本、高旋光纯度（≥99.9%）D-乳酸发酵的微生物菌株。考虑到蔗糖糖蜜和甜菜糖蜜等非粮原料在我国分布十分广泛且价格低廉，因此本论文拟构建一株可高效利用蔗糖且能产高光学纯度D-乳酸的大肠杆菌工程菌，并对其培养基成分以及发酵条件进行优化，为深入利用糖蜜资源，降低成本产高纯度D-乳酸打下良好基础。
首先，以可利用蔗糖的E.coliHBUT-D1（W,ΔfrdABCDΔadhEΔptaΔpflBΔaldA,Scr+）为出发菌株，通过λRed重组系统技术对大肠杆菌蔗糖利用的阻遏基因(cscR)进行敲除，得到一株可促进蔗糖运输和降解的大肠杆菌工程菌E.coli HBUT-D2。对HBUT-D2进一步进行厌氧生长驯化筛选，得到一株厌氧条件生长良好的菌株，相同发酵条件下其生物量比HBUT-D2增长了75%，且在无机盐培养基中能稳定生长，该菌株被命名为HBUT-D。
其次，对工程菌HBUT-D在不同糖发酵产乳酸的效果进行了比较。以10%蔗糖、10%葡萄糖和10%蔗糖糖蜜分别作为发酵培养基碳源摇瓶发酵72h，D-乳酸产量分别为66.45g/L、61.5g/L和14g/L。进一步以蔗糖为碳源，利用HBUT-D在7L和15L的规模上进行D-乳酸发酵，结果表明发酵72小时后，100g/L蔗糖得到了充分利用，同时产生88.15g/L乳酸且D-乳酸光学纯度达到99.9%；发酵摩尔转化率达到84.0%，生产强度为1.22g/(L?h)；发酵产物中其它竞争性副产物如甲酸、乙酸、L-乳酸、乙醇及琥珀酸的含量均很低。
最后，对工程菌HBUT-D的发酵条件进行了研究。通过单因素实验对接种量、糖浓度、甜菜碱添加、温度、装液量以及摇床转速等发酵条件进行了优化，确定大肠杆菌工程菌HBUT-D不依赖酸碱流加条件下发酵生产D-乳酸的最适条件：以60g/L CaCO3为中和剂，接种量为2%，以初始浓度为10%的蔗糖为碳源，添加1mM甜菜碱，摇瓶装液量为100ml液体培养基/250ml锥形瓶（NBS培养基），37℃，200r/min条件下发酵培养。在此条件下，D-乳酸产量可达到62g/L（光学纯度达到99.9%），比未优化前产量提高了38%。
首先，以可利用蔗糖的E.coliHBUT-D1（W,ΔfrdABCDΔadhEΔptaΔpflBΔaldA,Scr+）为出发菌株，通过λRed重组系统技术对大肠杆菌蔗糖利用的阻遏基因(cscR)进行敲除，得到一株可促进蔗糖运输和降解的大肠杆菌工程菌E.coli HBUT-D2。对HBUT-D2进一步进行厌氧生长驯化筛选，得到一株厌氧条件生长良好的菌株，相同发酵条件下其生物量比HBUT-D2增长了75%，且在无机盐培养基中能稳定生长，该菌株被命名为HBUT-D。
其次，对工程菌HBUT-D在不同糖发酵产乳酸的效果进行了比较。以10%蔗糖、10%葡萄糖和10%蔗糖糖蜜分别作为发酵培养基碳源摇瓶发酵72h，D-乳酸产量分别为66.45g/L、61.5g/L和14g/L。进一步以蔗糖为碳源，利用HBUT-D在7L和15L的规模上进行D-乳酸发酵，结果表明发酵72小时后，100g/L蔗糖得到了充分利用，同时产生88.15g/L乳酸且D-乳酸光学纯度达到99.9%；发酵摩尔转化率达到84.0%，生产强度为1.22g/(L?h)；发酵产物中其它竞争性副产物如甲酸、乙酸、L-乳酸、乙醇及琥珀酸的含量均很低。
最后，对工程菌HBUT-D的发酵条件进行了研究。通过单因素实验对接种量、糖浓度、甜菜碱添加、温度、装液量以及摇床转速等发酵条件进行了优化，确定大肠杆菌工程菌HBUT-D不依赖酸碱流加条件下发酵生产D-乳酸的最适条件：以60g/L CaCO3为中和剂，接种量为2%，以初始浓度为10%的蔗糖为碳源，添加1mM甜菜碱，摇瓶装液量为100ml液体培养基/250ml锥形瓶（NBS培养基），37℃，200r/min条件下发酵培养。在此条件下，D-乳酸产量可达到62g/L（光学纯度达到99.9%），比未优化前产量提高了38%。