论文部分内容阅读
两栖类皮肤活性肽具有广谱抗菌、抗病毒、抗真菌、抗肿瘤、抗寄生虫等活性，对正常真核细胞几乎无影响，因而从两栖类皮肤活性肽中筛选出某些具有广谱抗病毒作用的活性肽，使之成为新一代的抗病毒药物的来源，有着极其重要的意义。细胞培养技术是抗病毒药物筛选及抗病毒活性检测最常用的方法之一。该筛选方法具有敏感、特异、观察结果快、重复性好、检测量少等特点，是一种多作用靶点的筛选方法，漏筛几率小。方法：本试验以东北林蛙(Rana dybowskii)作为两栖类的代表物种，通过电刺激法(10V，20Hz)从皮肤中收集分泌物，经葡聚糖凝胶层析(Sephadex G-100、50、25)初级分离。建立高效液相色谱(HPLC，C18)纯化体系，确定流动相、洗脱时间、检测波长等最佳色谱纯化条件。利用已建立的SAH水解酶体外抗病毒初筛技术筛选经HPLC纯化得到的肽dybowskii。采用MDCK细胞培养技术及人流感病毒283C-1侵染对所筛选的活性肽dybowskii进行抗病毒活性检测，试验采用三种给药模式：①MDCK细胞先加活性肽dybowskii后接毒，观察活性肽dybowskii能否与细胞膜表面受体结合而阻止病毒的吸附和进入；②MDCK细胞先加病毒后加活性肽dybowskii，观察活性肽dybowskii对染毒细胞的作用；③活性肽dybowskii与病毒混合一段时间后加入MDCK细胞，观察活性肽dybowskii对病毒的直接灭活作用。通过MTT法检测MDCK细胞OD值判断活性肽dybowskii抗病毒活性，分析其抗病毒特征。实验结果：(1)通过对HPLC的流动相、流速等条件筛选，建立HPLC纯化体系，确定了最佳色谱纯化条件，即流动相为乙腈：甲醇：水-TFA(5∶5∶90)，流速为0.5ml／min，检测波长为216nm和280nm。Sephadex G-100、50、25凝胶层析初分离的多肽组分经HPLC分离纯化后共获得皮肤活性肽dybowskiiⅠ～Ⅺ。(2)经SAH水解酶体外抗病毒初筛技术筛选出对SAH水解酶有抑制作用的活性肽有dybowskiⅠ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ。(3)利用MDCK细胞培养技术观察活性肽dybowskii对人流感病毒283C-1作用的结果为：给药模式①下，0.121μg／ml dybowskiiⅢ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅶ对人流感病毒283C-1的吸附有抑制作用，抑制率分别为97.7％、91.7％、70.7％和78.2％；给药模式②下，浓度为0.12μg／ml dybowskiiⅣ抗病毒增殖作用最好，病毒抑制率可达到82.8％；给药模式③下，所筛选的活性肽dybowskii与病毒对照组OD值无显著差异(P＞0.05)，抗病毒效果不明显。结论：(1)本试验建立了HPLC对东北林蛙皮肤分泌物纯化体系，分离得到皮肤活性肽dybowskiiⅠ～Ⅺ。(2)试验利用已建立的SAH水解酶活性抑制的体外广谱抗病毒初筛模型筛选出对SAH水解酶有抑制作用的活性肽dybowskiⅠ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ。(3)试验采用体外细胞培养技术，通过3种作用模式：抗病毒吸附作用、抑制病毒增殖作用和直接灭活病毒作用筛选出东北林蛙皮肤分泌物中抗流感病毒成分，为研究东北林蛙皮肤分泌物抗病毒作用机理提供了新的实验方法和探索途径。在中国拥有丰富的两栖类动物资源，由其是黑龙江地区丰富的东北林蛙资源。本试验从东北林蛙皮肤分泌物中筛选出具有抗病毒活性的多肽分子，为今后其大规模的开发应用，并使之成为新一代安全、有效、特异的抗病毒药来源奠定试验基础。