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目的:研究乙酰化酶P300介导的CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer-binding protein beta,C/EBPβ)乙酰化修饰对髓源性抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)免疫抑制功能的调控作用,并对其可能的分子机制进行探讨,为针对髓源性抑制细胞的免疫治疗提供一些新的实验依据。方法:(1)皮下注射Lewis细胞以构建肺癌移植瘤模型,采用免疫磁珠法分选荷瘤小鼠脾脏来源CD11b~+Gr1~+MDSCs细胞,流式细胞术(Flow cytometry,FCM)鉴定细胞纯度。应用免疫共沉淀技术(CO-Immunoprecipitation,CO-IP)检测荷瘤小鼠脾脏来源MDSCs中C/EBPβ乙酰化水平,CO-IP检测C/EBPβ与P300是否相互结合,免疫荧光技术检测C/EBPβ与P300是否存在共定位。采用P300特异性抑制剂C646,I类组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylases inhibitors,HDACi)CI994,HDAC1、2、3特异性抑制剂Pyroxamid、Santacruzamate A、RGFP966分别处理荷瘤小鼠脾脏来源MDSCs,24h后,采用CO-IP方法检测MDSCs中C/EBPβ乙酰化水平变化。(2)应用Western-blot技术检测野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏来源MDSCs中P300的蛋白表达水平,同时使用CO-IP技术检测不同来源MDSCs中C/EBPβ乙酰化水平。野生型小鼠脾脏来源MDSCs加入Lewis肿瘤细胞培养上清,培养48h后,检测P300表达。在MDSCs培养体系中加入鼠IL-6Rα抗体,阻断IL-6信号,再加入Lewis肿瘤细胞培养上清,然后检测P300表达。采用不同浓度IL-6处理荷瘤小鼠脾脏来源MDSCs,Western-blot法检测MDSCs中P300的表达情况;同时,CO-IP法检测MDSCs中C/EBPβ乙酰化水平。(3)将C646处理的MDSCs加入CD4~+T细胞增殖培养体系,培养3天,CFSE染色法检测CD4~+T细胞的增殖能力,观察MDSCs对CD4~+T细胞增殖的抑制能力。将P300特异性抑制剂C646加入荷瘤小鼠脾脏来源MDSCs,培养24h,qRT-PCR检测MDSCs相关效应分子Arg-1、iNOS转录水平的改变,精氨酸酶检测试剂盒检测Arg-1酶活性。分离野生型小鼠骨髓细胞,加入20ng/mL IL-6和20ng/mL GM-CSF体外诱导MDSCs,于第一天同时加入P300抑制剂C646,每天测定每组Arg-1活性,第三天FCM检测分化MDSCs比例。此外,构建GV366-Cebpb-HA、GV141-Ep300-Flag过表达载体、报告基因载体GV238-Arg1-promoter-Luc,将上述质粒共转染入HEK293T细胞后检测荧光素酶活性,验证P300是否促进C/EBPβ对靶基因Arg-1的转录调控。(4)我们将野生型C57BL/6小鼠分为PBS组、MDSCs组、DMSO-MDSCs组、C646-MDSCs组,小鼠皮下注射1x10~6Lewis细胞,待小鼠肿瘤长至黄豆粒大小(Day8),吉西他滨预处理1周以消除小鼠体内MDSCs,之后按不同组别每只老鼠分别在肿瘤多点注射PBS、1x10~6MDSCs、1x10~6DMSO处理的MDSCs以及1x10~6C646处理的MDSCs,观察各组别肿瘤的生长进程。于Lewis细胞皮下注射的第28天处死小鼠,剥离各组别小鼠肿瘤组织并称重。结果:(1)荷瘤小鼠脾脏来源的MDSCs分选纯度达90%以上,满足后期实验使用。荷瘤小鼠脾脏来源MDSCs中C/EBPβ存在乙酰化修饰现象。CO-IP实验与免疫荧光技术证实C/EBPβ与P300相互结合。荷瘤小鼠脾脏来源MDSCs经P300抑制剂C646处理24h后,CO-IP技术检测到C/EBPβ乙酰化水平下降。荷瘤小鼠脾脏来源MDSCs经I类HDAC抑制剂CI994或者HDAC2特异性抑制剂Santacruzamate A处理24h后,CO-IP技术检测到C/EBPβ乙酰化水平上升。结果表明,荷瘤小鼠脾脏来源MDSCs中C/EBPβ存在乙酰化修饰现象,且受P300和HDAC2的调控。(2)与野生型小鼠脾脏来源MDSCs相比,荷瘤小鼠脾脏来源MDSCs中P300表达增加,且C/EBPβ乙酰化水平上调。Lewis肿瘤细胞培养上清可促进野生型小鼠脾脏来源MDSCs中P300的表达,而在同样培养体系中加入鼠IL-6Rα抗体后,P300表达明显下降。荷瘤小鼠脾脏来源MDSCs加入IL-6处理48h后,MDSCs中P300的表达增加,C/EBPβ乙酰化水平也出现上调。以上结果表明,肿瘤细胞来源的IL-6可以增加MDSCs中P300表达,影响C/EBPβ的乙酰化水平。(3)将C646预处理24h的荷瘤小鼠脾脏来源MDSCs与CD4~+T细胞共培养3天,结果显示C646处理组的CD4~+T细胞的增殖能力高于DMSO对照组,表明特异性抑制MDSCs中P300后,MDSCs对CD4~+T细胞增殖的抑制作用减弱。P300抑制剂C646能够降低MDSCs中Arg-1的mRNA水平,同时下调MDSCs中Arg-1的酶活性。在体外诱导MDSCs体系中,C646并不改变iMDSCs的比例,PMN-MDSCs、M-MDSCs亚群比例也无明显变化,但Arg-1酶活性明显下降。此外,通过JASPAR数据库预测和文献查找,我们预测到C/EBPβ结合在靶基因Arg-1的启动子区域,直接调节Arg-1的转录。荧光素酶报告基因实验显示P300促进C/EBPβ的转录激活活性,进而促进靶基因Arg-1的转录。(4)体内实验显示,与DMSO-MDSCs对照组相比,C646-MDSCs组肿瘤的发展进程延缓,肿瘤的体积和重量明显减少。结论:MDSCs细胞中C/EBPβ存在乙酰化修饰现象,且受乙酰化酶P300和去乙酰化酶HDAC2的调节。肿瘤细胞来源的IL-6可以增加MDSCs细胞中P300表达,上调C/EBPβ的乙酰化水平。乙酰化酶P300可介导MDSCs细胞中C/EBPβ乙酰化,促进Arg-1的转录,调控MDSCs的免疫抑制功能。