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脑胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤，其发病率、死亡率最高，发病率为3～10/10万，占颅内肿瘤的46%，占全身恶性肿瘤的1%～3%，5年存活率为20%～30%，是中枢神经系统疾病的难点。手术切除和放射治疗(RT)辅以化疗是当前治疗标准，但神经胶质瘤对治疗抵抗，也使得神经胶质瘤的预后极差，平均生存期为12到15个月。虽然近年神经影像学和术中肿瘤示踪技术的发展与应用，使神经胶质瘤的治疗取得了一定的进展，但也难以保证以手术为主的治疗能完全根除肿瘤，其根本原因是脑胶质瘤的生长特点造成的。近年针对神经胶质瘤的分子靶标研制、开发了靶向治疗药物，临床试验有一定的治疗效果，但远未达到预期结果。此外，尽管科学工作者对肿瘤侵袭性生长的机制进行了大量研究，仍然不能深入了解脑胶质瘤浸润性生长的机制，因此深入研究其机制，寻找到其有效治疗的途径，是治疗神经胶质瘤、提高患者生存质量的关键。肿瘤转移是恶性肿瘤的生物学特点，细胞运动能力增强导致其迁移和侵袭，细胞骨架的重塑是直接原因，而Ezrin是肌动蛋白与细胞膜及膜表面受体连接的桥梁，参与多种肌动蛋白的功能如细胞粘附，细胞运动和形态发生。在多种肿瘤组织表达上调，包括脑胶质瘤。但Ezrin在胶质瘤浸润性生长中的作用不清楚。结合脑胶质瘤的生物学特性、治疗现状和Ezrin基因在肿瘤迁移和侵袭中的作用，本文研究了Ezrin与胶质瘤细胞U251和U87浸润性生长的相关性，并对其机制进行了探讨，主要研究结果：1、成功构建Ezrin基因的shRNA表达载体，以脂质体Lipofectimine2000介导转染U87细胞，RT-PCR和Western blot检测结果表明，shRNA-Ezrin-2可沉默Ezrin表达，使其mRNA和蛋白表达量降低，确定为有效shRNA载体。2、成功构建Ezrin基因表达载体pEGFP-C1/Ezrin。Western blot检测重组载体pEGFP-C1/Ezrin转染组Ezrin表达量高于空载体pEGFP-C1转染组和空白对照组。3、shRNA-Ezrin-2与过表达载体pEGFP-C1/Ezrin分别转染U251和U87细胞，划痕试验结果显示Ezrin shRNA可阻断U251和U87细胞迁移，其过表达可促进细胞迁移。裸鼠脑瘤模型结果显示，与对照组对比，转染shRNA-Ezrin-2的细胞迁移数少，而转染pEGFP-C1/Ezrin的细胞迁移数相对较多，表明Ezrin基因沉默可阻断U251和U87细胞浸润性生长，过表达可促进迁移，增强其浸润生长，由此判断Ezrin参与U251和U87细胞浸润性生长。4、为探讨Ezrin影响U251和U87细胞迁移、浸润性生长的机制，RT-PCR和Western blot分析shRNA-Ezrin-2与过表达载体pEGFP-C1/Ezrin转染细胞的Rac1的表达，结果显示，pEGFP-C1/Ezrin转染组Rac1表达量高于shRNA-Ezrin-2转染组和对照组，而shRNA-Ezrin-2转染组低于对照组。表明Ezrin可激活Rac1，Ezrin对U251和U87细胞的影响是通过Rac1实现的。5、Transwell发现U87细胞的迁移能力强于U251细胞，为分析这种差异的原因，对Ezrin结构进行了分析，结果显示，U87细胞的Ezrin蛋白在第66、258、265和577位发生变异，而C端的34氨基酸是Ezrin与F-actin结合的位点，N端的296个氨基酸是与C端107个氨基酸残基相联系的功能域[22]，在此区域内发生氨基酸变异，是否影响Ezrin与F-actin或细胞膜的结合而影响其功能，从而影响细胞的迁移。本研究对具有不同浸润能力的脑胶质瘤细胞U251和U87的Ezrin蛋白功能和结构通过生物信息学方法加以分析、说明。Ezrin的蛋白功能分析显示，与U251细胞Ezrin“matched”的蛋白有362个，与U87细胞Ezrin“matched”的蛋白却有1503个；Ezrin的结构分析显示，U87细胞Ezrin的PDB多于U251细胞的，而SCOP和CATH所显示的结构域的结构分级和分层分级相同；U87细胞Ezrin的“Domain organisation”有45个，而U251细胞的Ezrin只有5个。SWISS-MODEL进一步分析，Coloring by residue error，U87细胞Ezrin有8处与U251细胞的不同，QMEAN4评分U87细胞Ezrin低于U251细胞的；SWISS-PDBViewer显示第258、265位氨基酸相对位于空间结构的内侧。推测U87细胞Ezrin的功能、结构域及空间结构均不同于U251细胞，导致了U251和U87细胞的迁移和浸润能力不同。6、为验证Ezrin蛋白结构的差异造成U251和U87细胞迁移和浸润能力不同，本研究将U251细胞的Ezrin转染U87细胞，再将U87细胞的转染U251细胞，结果显示pEGFP-C1/Ezrin87转染的U251细胞大量迁移至伤口，伤口愈合较快，而转染pEGFP-C1/Ezrin251的U87细胞迁移的细胞数少于pEGFP-C1/Ezrin87转染组，伤口愈合较慢。裸鼠脑瘤动物模型也证实了这种结果。Rac1的表达量也与这种结果吻合。表明Ezrin可造成U251和U87细胞迁移、侵袭能力不同，且通过激活Rac1实现的。