莱姆病又称莱姆包柔体病或莱姆疏螺旋体病,是因感染伯氏疏螺旋体引起的由蜱为媒介传播的人畜共患传染病。伯氏疏螺旋体是莱姆病的主要病原体,在分类学上属于螺旋体目、螺旋体科中的包柔螺旋体属,也称疏螺旋体属。莱姆病最初于1977年在美国康涅狄格州的莱姆镇发现,因而得名。莱姆病临床表现复杂,早期以慢性游走性红斑为特征性表现,后可累及心脏、关节、神经系统,严重者可致死亡。莱姆病在世界上分布广泛,遍布五大洲70多个国家,且发病人数在逐年增加,疫区不断扩大,以美国发病率最高,我国也证实存在莱姆病的发病和流行,部分省(市)存在自然疫源地,严重危害人民健康和经济发展,1992年WHO已将此病列为重点防治对象。随着我国与世界各国贸易往来的与日俱增,出入境流动人口的逐年增加,为病原体的传播和转移提供了可能性,因此加强国境口岸的病原学检测成为当务之急,必须做到早发现,早防控,保障边境地区的安全与稳定。目前,莱姆病的实验室检查方法主要有血象分析、病原体分离、血清学和分子生物学方法,各有不足。病原体分离是金标准,以病变周围皮肤取样阳性率最高,但耗时耗力,不是首选方法。免疫学检测法主要有间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验,快速简便,但存在一定的假阳性和假阴性。分子生物学方法主要包括常规PCR方法和实时荧光定量PCR方法,由于实时荧光定量PCR具有快速、敏感性高、特异性高、可定量、易于推广的优点,本研究拟建立能检测伯氏疏螺旋体的多重实时荧光定量PCR方法并同时对菌株的基因型分型,用于国境口岸莱姆病螺旋体的快速筛查。目的:本研究拟开展蜱媒传染病莱姆病的监测检测技术研究,建立一种伯氏疏螺旋体的多重实时荧光定量PCR的快速检测方法,可对伯氏疏螺旋体三种致病基因型伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和狭义伯氏疏螺旋体检测并同时分型。方法:从genbank中检索伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和狭义伯氏疏螺旋体的代表株的外膜蛋白ospc的全长序列,用mega5.0软件比对,用primerpremier5.0软件设计常规pcr全长引物,以购自美国模式菌种保藏中心的三型标准菌株的基因组核酸为模板做pcr用于ta克隆构建标准质粒,用作荧光定量pcr的质粒模板标准品。在标准质粒的保守序列设计荧光pcr的型通用引物和型特异探针,三条探针分别标记fam、texasred和cy5荧光报告基团,以标准质粒为模板,分别建立及优化伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和狭义伯氏疏螺旋体的单重实时荧光定量pcr方法及分型多重实时荧光定量pcr方法,优化反应体系,分析其敏感性和特异性,再以三型标准菌株的基因组核酸为模板做检测以验证本方法的科学性和有效性,并初步应用于长白口岸蜱虫的莱姆病螺旋体的检测。结果:①建立的伽氏疏螺旋体单重实时荧光定量pcr方法具有很好的灵敏性,最低检测值为40copies/μl。②建立的阿氏疏螺旋体单重实时荧光定量pcr方法具有很好的灵敏性,最低检测值为5.17copies/μl。③建立的狭义伯氏疏螺旋体单重实时荧光定量pcr方法具有很好的敏感性,最低检测值为3.78copies/μl。④建立的伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和狭义伯氏疏螺旋体的分型多重实时荧光定量pcr方法具有很好的灵敏性和特异性,对伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和狭义伯氏疏螺旋体的最低检测值分别为40copies/μl、5.17copies/μl和38copies/μl;与蜱传病原立克次体、土拉弗朗西斯菌均无交叉反应,特异性佳。用本实验所建立的伯氏疏螺旋体taqman探针分型多重实时荧光定量pcr方法检测2009年5月采自长白山口岸的蜱虫标本72只,结果9只长角血蜱检测为阳性,均为b.garinii型,经常规pcr测序比对证实均为伽氏疏螺旋体型,结果一致,证明了本方法的可靠性。结论:本研究建立的伯氏疏螺旋体分型多重实时荧光定量PCR方法能快速检测伯氏疏螺旋体并同时分型,适用于国境口岸莱姆病螺旋体的快速检测。