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实验背景:根据Cancer Statistics研究,肺癌的死亡率在全球居首位,发病率全球第二,非小细胞肺癌在肺癌中占比最高,且5年生存率低。对于非小细胞肺癌的治疗,紫杉醇是基础化疗药物之一,但多药耐药(MDR)是影响紫杉醇疗效的主要原因。研究表明,在肿瘤的治疗的过程中,影响化疗的主要原因是多药耐药,化疗药物在临床当中产生多药耐药极易影响其治疗的效果。微管是治疗肿瘤的重要靶点,与紫杉醇位点和长春新碱位点的微管蛋白抑制剂相比,作用于秋水仙碱位点的微管蛋白抑制剂能够克服P-gp调控的多药耐药。实验目的:探讨新型微管蛋白抑制剂TH320抗A549/Taxol细胞的多药耐药作用及机制。实验方法:采用MTT法检测TH320对多种肿瘤细胞生长抑制的影响及A549/Taxol细胞对多种化合物的耐药倍数。采用罗丹明(Rh123)蓄积实验检测TH320对P-gp外排功能及表达量的影响。采用倒置荧光显微镜观察TH320对A549和A549/Taxol细胞形态学的影响。采用免疫荧光法β-tubulin染色观察TH320对细胞内微管影响。流式细胞仪检测TH320对A549和A549/Taxol细胞凋亡(Annexin V/PI)、细胞的周期(PI)、自噬(MDC)、活性氧(DHE)的影响。Hoechst33342染色观察TH320对A549/Taxol细胞核变化的影响。细胞衰老β-半乳糖苷酶染色观察TH320引起A549/Taxol细胞衰老。采用Western blot检测TH320对A549/Taxol细胞内周期蛋白(cyclin B1、p-H3、cdc2、p-cdc2)、凋亡蛋白(Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2、XIAP)及细胞色素C变化、衰老蛋白(Rb、p-Rb、p21、p16)、自噬蛋白(ATG5、LC3、SQSTM/p62)和P-gp蛋白的影响。实验结果:1.TH320在多种肿瘤细胞中表现出较强的细胞毒活性。与CA-4相比对正常细胞毒性小,呈剂量和时间依赖性抑制A549和A549/Taxol细胞增殖。2.使用多种化合物检测A549/Taxol细胞的耐药倍数,对紫杉醇和CA-4耐药倍数较高,说明A549/Taxol细胞耐药性强。对TH320耐药倍数仅为0.6倍,说明TH320能够抗耐药。3.免疫荧光法检测TH320、CA-4、Taxol对A549/Taxol细胞微管蛋白的影响,共聚焦观察TH320和CA-4抑制微管聚合,Taxol促进微管聚合。4.Western blot检测P-gp在A549/Taxol细胞中高表达,在A549细胞中不表达,表明A549/Taxol有很强的耐药性,且TH320呈时间依赖性降低A549/Taxol细胞P-gp的表达;罗丹明蓄积实验表明TH320抑制P-gp外排。5.TH320作用A549和A549/Taxol产生不同的细胞形态变化和细胞核变化,A549发生凋亡,细胞皱缩变圆;A549/Taxol细胞核变大出现多核和微核,细胞形态变大变扁平。6.TH320诱导A549/Taxol细胞凋亡、周期阻滞、衰老、自噬和活性氧的产生,且呈时间依赖性。7.Western blot实验表明TH320调控A549/Taxol细胞凋亡蛋白active-caspase-3、active-caspase-8、active-caspase-9、Bax上调,Bcl-2、XIAP下调;周期蛋白cyclin B1、p-H3、cdc2下调,p-cdc2上调;衰老蛋白Rb、p21、p16上调,p-Rb下调;自噬蛋白ATG5、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ上调,SQSTM/p62下调表达。8.流式细胞术检测表明蛋白酶体抑制剂MG132、Bortezomib、Carfilzomib抑制TH320诱导凋亡、周期阻滞、自噬和活性氧,经细胞衰老β-半乳糖苷酶染色表明也可抑制衰老发生。9.Western blot实验表明蛋白酶体抑制剂MG132、Bortezomib、Carfilzomib可以逆转TH320对凋亡、周期、衰老及自噬相关蛋白的调控。实验结论:新型微管蛋白抑制剂TH320对A549/Taxol细胞有较强的生长抑制作用,其以微管蛋白为靶点,通过抑制微管聚合,诱导细胞凋亡,并能引起周期阻滞、衰老、自噬和活性氧的产生从而发挥抗耐药作用。蛋白酶体在TH320抗耐药作用中具有重要作用。